２本鎖形成ピレン修飾核酸の蛍光発光によるジストロフィンmRNAの可視化

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K15395
• 研究機関: 神戸学院大学
• 研究代表者: 松尾 雅文 神戸学院大学, 総合リハビリテーション学部, 教授 (10157266)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: エクソンスキッピング / ジストロフィン遺伝子 / スプライシング

研究実績の概要

ジストロフィン遺伝子内の７９ケのエクソンの中で、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療としてエクソンスキッピングの有力な対象となる１１のエクソンがある。これらのエクソンのスキッピングを誘導する化合物の同定は喫緊の課題である。これまでに、これら１１のエクソンを対象としてミニ遺伝子を構築し、それらのスプライシングを一挙に解析できる高性能スプライシングアッセイ系を構築してきた。この系では、スプライシング産物を逆転写・PCR法により解析し、エクソンスキッピング誘導能を同定した。本研究は、これをさらに高性能化するため、エクソンスキッピングしたｍRNAを蛍光を用いた直接検出する方法の確立をはかるものである。
高性能スプライジングアッセイ系の実用性について証拠を得るために、候補となる化合物を用いてそのエクソンスキッピング誘導能を既確立のRT-PCR法により解析した。その結果、ある化合物があるエクソンのスキッピングを誘導する結果を得つつある。本システムの有効性が明らかにかった。
一方、細胞内に導入したミニ遺伝子から産生される標的ｍRNAの蛍光による検出については、検出のためのレーザー波長の検討、検出能の分析、検出システムの再構築などの検討を実施した。そして、標的となるRNAの人工合成、プローブとなるENA核酸配列の選択と合成などを行った。こうして蛍光検出系の基盤の整備を進めてきた。今後、こうした基盤に立ち当初の蛍光検出システムの確立をはかる予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ミニ遺伝子より産生されるエクソンスキッピングを有するmRNAの蛍光検出システムの構築に関して、レーザー波長の検討、検出能の分析などを通じて行った。そして、標的となるRNAの人工合成、プローブとなるENA核酸配列の選択と合成などを行った。これらは、計画していたことであり、おおむね予定通りに進行している。

今後の研究の推進方策

これまでに検討してきた成果をもとに、高性能スプライシングアッセイ系を進化された蛍光検出系を構築するものである。まず、in vitroでこの系を確立し、ついで生細胞を用いた検討を行うものである。