不活化変異の導入を治療原理とした多変異対応型遺伝子医療の実証的研究

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K15415
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 秋山 真志 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (60222551)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 皮膚科学 / KID症候群 / GJB2 / トランスジェニックマウス

研究実績の概要

従来個々の遺伝子変異に個別に対応する方向で遺伝子編集による治療が研究されてきたが、当研究の不活化遺伝子を導入する治療法では、複数の遺伝子変異に効果を示す不活化変異を導入する汎用ベクターセットで治療できる可能性がある。GJB2-G45E mutantのみのKID症候群モデルマウスで検討するのでは十分でなく、複数の遺伝子変異のマウスモデルを作成する必要があった。したがって、KID症候群の変異遺伝子で、症例および研究報告の多い、GJB2-G12R、GJB2-G45E、GJB2-D50N mutantsの３系統のモデルマウスを作成することを検討した。
優性変異であるKID症候群の変異遺伝子上記3系統について、それぞれFLAG-tagを付加した融合タンパクに加え、緑色蛍光タンパクであるEGFPをIRESの存在下で発現するコンストラクトを作成した。構築する遺伝子改変マウスを3系統に増やす必要上、ドキシサイクリン依存性転写配列をノックインするのではなく、遺伝子導入された時点から変異遺伝子が発現するトランスジェニックマウスを作成する方針へ計画を修正した。
BLACK-6Jのマウスを使用し、pIRES2-AcGFP1ベクター（タカラバイオ株式会社）に上記コンストラクトを乗せ換えて使用した。発現プロモーターは、pIRES2-AcGFP1ベクターのCMVプロモーターをそのまま使用した。作成したトランスジェニックマウスの組織からPCRで変異遺伝子の存在を確認した。しかし、FLAG融合タンパクおよびEGFPの発現を確認できず、生体でのタンパク質発現が確認できなかった。この原因として、げっ歯類の胎盤にGJB2がコードするコネキシン26が発現しており、これによって胎生期に胎児へのグルコース輸送を阻害され胎生致死にいたっている可能性（Gabriel HD, et al. J Cell Biol. 1998）や、変異遺伝子がうまくタンパク発現されない場所に挿入されているなどの可能性が考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Unilaterally dominant acrokeratoelastoidosis (punctate palmoplantar keratoderma type 3). (2017)
  • 著者名/発表者名: Taki T, Ogawa Y, Sakakibara A, Kono M, Akiyama M.
  • 雑誌名: Br J Dermatol 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Erythrokeratoderma variabilis caused by p.Gly45Glu in connexin 31: the importance of the first extracellular loop glycine residue of connexins for gap junction function. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takeichi T, Sugiura K, Hsu C-K, Nomura T, Takama H, Simpson MA, Shimizu H, McGrath JA, Akiyama M.
  • 雑誌名: Acta Dermato-Venereol 巻: 96 ページ: 557-559
  • DOI: 10.2340/00015555-2307.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Large intragenic KRT1 deletion underlying atypical autosomal dominant keratinopathic ichthyosis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takeichi T, Liu L, Abdul-Wahab A, McMillan JR, Stone KL, Akiyama M, Simpson MA, Parsons M, Mellerio JE, McGrath JA.
  • 雑誌名: J Invest Dermatol 巻: 136(10) ページ: 2095-2098
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2017.01.014.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 先天性魚鱗癬の病態解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 秋山真志
  • 学会等名: 平成２８年度愛知県難病教育講演会
  • 発表場所: 愛知県医師会館（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2016-11-02 – 2016-11-02
  • 招待講演
• [学会発表] シンポジウム１ 皮膚難病克服への挑戦：魚鱗癬・魚鱗癬症候群の病態解明と克服への挑戦 (2016)
  • 著者名/発表者名: 秋山真志
  • 学会等名: 第67回 日本皮膚科学会 中部支部学術大会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪府大阪市）
  • 年月日: 2016-10-22 – 2016-10-22
  • 招待講演
• [学会発表] 教育講演：皮膚のバリア機能を担う分子と構造（かたち） (2016)
  • 著者名/発表者名: 秋山真志
  • 学会等名: 第43回皮膚かたち研究学会学術大会
  • 発表場所: ヒューリックホール（東京都台東区）
  • 年月日: 2016-06-19 – 2016-06-19
  • 招待講演