| 研究課題/領域番号 |
15K15420
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
吉村 康秀 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60263307)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | revertant mosaicism / 相同組換え / Loss Of Heterozygosity / ブルーム遺伝子 / CRISPR/Cas9 / トiPS細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
表皮水疱症をはじめ、多くの疾患で、本来ゲノム上に存在している変異（病因因子）の消えたrevertant mosaicismが生じる現象が知られている。表皮水疱症の場合、生じるrevertant細胞によって一時的に症状が寛解する。revertant細胞に関して、我々は皮膚幹細胞における相同組換えによるrevertant細胞の生成の可能性を考えている。revertant細胞を意図的に作成することができれば、それはそのまま治療に用いることが出来る。ヒトiPS細胞においてブルーム遺伝子の発現制御により染色体が相同組換えを起こし、Loss Of Heterozygosity (LOH)を生じたクローンを治療と病院因子の探索に用いるのが本研究の目的である。平成２７年度は、CRISPR/Cas9 システムを利用して、LOHクローンを効率よく得る手法の開発に成功した。また、その手法によって得られた、ヒト19番染色体の43M近傍に存在するPSG locusのLOHクローンの表現型解析から、酸化損傷抵抗性に関与することが示唆されていた本領域が、我々が使用したiPS細胞では実際に細胞増殖や酸化損傷抵抗性に関与しているデータを得ており、本システムの有効性が示された。導入遺伝子が安定して発現するAAVS1 locusが存在することからモデルとして選んだ19番染色体で、システムが機能することが示唆された。このため当初の予定通り、３次元培養皮膚モデルで表現型の検出が可能と考えられるダリエー病における小胞体カルシウムポンプ(SERCA2b) L321F変異導入をはじめ、いくつかの病因遺伝子と、それを引き起こす点変異が同定されている疾患に関して、使用しているiPS細胞で同じ変異がない場合は、それを導入して表現型との相関を捉える実験系の確立に移行している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ブルーム遺伝子の発現制御だけでは、染色体が組換えを起こしてLoss Of Heterozygosity (LOH)を生じたクローンは、100万個あたり１～２個程度であった。これがPAM配列にG or AのSNP配列を含んだCRISPRで染色体の片アリルだけ（NGG側）をブルーム遺伝子の発現制御下で切断したところ、LOHクローンは100万個あたり10個程度と、効率が飛躍的に向上した。通常の両アリルを切断するCRISPRでは、100万個あたり２～３個程度と、効率はそれほど上がらない。この事は、本研究により開発された“SNP情報を元にした片アリル切断する手法”がLOHクローンを得るのに有効であることを示していると考えられる。この手法をベースとして用いて、ゲノムワイドに皮膚疾患に関与する未知の病院因子探索へとつなげてゆく。
|
| 今後の研究の推進方策 |
我々は、トランスポゾンを用いた遺伝子導入システムを、ヒトiPS細胞においてすでに確立している(Igawa K. Yoshimura Y et al.Stem Cells Transl Med. 2014)。このシステムは、トランスポゾンの認識配列を導入遺伝子カセットの両端に挿入したもので、導入してリプログラミングを起こすなどの目的を達した後に、ゲノム上から完全に除くことができる。このため、導入遺伝子カセットの痕跡はゲノム上には全く残らない。このシステムを、相同組換えを起して部分的に片方のアリルだけとなったLOHクローンを選択するためのnep/puro選択カセットにも応用し、ゲノムワイドに挿入する。各染色体あたり５～７個程度の選択カセット導入クローンを得て、皮膚疾患に関与が示唆される領域近傍に挿入されたクローンを選ぶ。これを用いて、すでに手法を確立しているiPS細胞からケラチノサイトへの分化、さらに３次元培養皮膚モデルにおいて表現型の解析を行う。
|
