| 研究課題/領域番号 |
15K15459
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| 研究機関 | 京都薬科大学 |
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研究代表者 |
河嶋 秀和 京都薬科大学, 薬学部, 准教授 (70359438)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 炎症 / マクロファージ / 分子イメージング / 放射線 / プリン受容体 |
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| 研究実績の概要 |
炎症性組織に集積したマクロファージ様細胞は、プリン受容体（P2Y6サブタイプ）を高密度に発現することが報告されている。本研究の目的は、P2Y6受容体を標的とした新規放射性分子プローブを開発し、新たな観点から炎症性疾患の病態解明に向けたアプローチを試みることにある。平成27年度は、目的とするプローブの母体化合物および放射性同位元素による標識に向けた非放射性化合物の合成につき、反応条件検討を実施した。
P2Y6受容体のアゴニストであるuridine diphosphate（UDP）の構造活性相関に関する考察から、受容体親和性が保存されるuridine骨格C5位に放射性ヨウ素を導入した化合物（[125I]5-I-UDP）の合成を目標とした。そこで、基盤技術として連携研究者の大倉が開発したN-iodosuccinimide（NIS）を用いる求電子置換反応に基づきuridineから5-iodouridineを合成後、リン酸基を伸長する経路について検討し、反応の進行を確認した。UDPは分子内にリン酸基を有することからヨウ素カチオンによるヨウ素化が効率的に進行しないと推察されたため、上記のような段階的反応による標識法を考案したが、これは放射性ヌクレオチド化合物の合成において有用なデータと考えられる。
当該研究領域に関しては、今後はN-chlorosuccinimide（NCS）と[125I]NaIとの反応で得られる[125I]NISを用いて[125I]5-iodouridineを標識合成し、その後のリン酸化を経て[125I]5-I-UDPを合成するとともに、固相抽出法やHPLCを組み合わせた精製技術を確立する。さらに、P2Y6受容体発現細胞を用いたin vitro実験を実施し、[125I]5-I-UDPの受容体結合特性に関する基礎的知見を得る計画である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
炎症性組織におけるマクロファージ様細胞に発現し、phagocytosisへの関与が示唆されているP2Y6受容体を標的とした新規放射性分子プローブ：[125I]5-I-UDPの開発を目指し、合成に関する検討を行った。まず、直接的にUDPのuridine骨格C5位へヨウ素を導入することを試みた。すなわち、UDP二ナトリウムを出発原料とし、アセトニトリル、アセトンあるいはIonic Liquid中、種々の条件下で非放射性NISを作用させたが、反応は進行しなかった。ヌクレオチドであるuridineに対しては対応するヨウ素体が得られたことから、これは解離して負電荷を帯びたリン酸基の影響により、ヨウ素カチオンの求電子的置換に至らなかったためと考えられた。そこで、まず5-iodouridineを作製後、そのC5’位の水酸基にリン酸基を伸長させることにより5-I-UDPを合成する反応経路について検討した。実際の放射性ヨウ素を用いた標識を考慮し、NCS/NaIを混合したIonic Liquidにuridineを作用させた。さらに、反応混合液中にリン酸化試薬を順次添加することで、トレーサー量の5-I-UDPの生成を質量分析にて確認した。本化合物の精製に関しては、親水性化合物に対して高い保持能が期待される逆相系HPLCカラムを用いた分離条件を検討中である。
以上、非放射性化合物の合成について一定の成果は得られたものの、放射性分子プローブの合成は達成できなかったため、評価は「やや遅れている」とした。
なお、作製した[125I]5-I-UDPは担癌動物を用いて腫瘍関連マクロファージへの集積性を確認する予定であるが、そのための複数の細胞（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株A431、ヒト肺腺癌細胞株H1975等）は継代培養し、動物への接種が可能なだけの数量を既に確保した。
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| 今後の研究の推進方策 |
P2Y6受容体に対する[125I]5-I-UDPの親和性について、その基礎評価を優先的に実施する。すなわち、NCS/[125I]NaIを用いた段階的反応により合成した[125I]5-I-UDPを精製、同定後、P2Y6を発現させたヒトアストロサイトーマ細胞株1321N1への結合性を、経時的な放射能取込み量から評価する。また、免疫不全マウスにA431等の腫瘍細胞を接種することで作製した担癌動物に[125I]5-I-UDPを静脈内投与し、臓器摘出法を用いて体内動態を経時的に測定するとともに、炎症性組織内部における放射能分布をオートラジオグラフィ等の手法により精査する。組織切片は免疫組織化学染色を施し、適宜、病理学的知見（P2Y6受容体を発現したマクロファージ様細胞の分布）と比較する。プローブの有用性が確認された場合は、抗腫瘍薬や抗炎症薬をモデル動物に投与し、治療を施した際の生体応答と放射能集積との整合性を検証する。
一方、本研究課題では末梢性のマクロファージ様細胞のみならず、アルツハイマー型認知症や脳血管病変等、脳機能障害に付随する炎症時に活性化を認める貪食性ミクログリアも定量評価の対象に考えている。しかし、5-I-UDPの分子量は530であり、また脂溶性の指標となるLog P値（Chem Officeソフトを用いた計算値）は0.09と低く、血液脳関門透過性は高くないことが予想されることから、P2Y6受容体と選択的に結合する、比較的脂溶性が高い低分子化合物の探索を試みる。本目的に際しては必要に応じて計算化学的手法を活用し、放射性同位元素を導入する官能基もメチル基やアミノ基を含めて柔軟に対応することで、positron emission tomography（PET）診断への発展性について併せて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請者は平成27年度中に北海道医療大学医療大学から京都薬科大学へと異動した。これに伴い一時的に研究と予算執行が滞ったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究内容に変更が生じた訳ではないので、当該助成金の使用については当初の予定通り、薬品や細胞、動物などに充てる計画である。
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