研究課題
筋は運動機能における動力源であり、組織幹細胞による再生メカニズムとMyoDに始まる発生分化転写制御システムの研究モデルとして長らく医学・生物学をリードしてきた。我々は、筋分化に必須の転写因子としてRp58を同定、さらに、ヒト筋芽細胞の分化系を用いたゲノムワイドなメチル化解析で、Human myoblastの分化過程において筋関連遺伝子の多くでpromoter領域のDNAメチル化レベルの上昇が見られることを発見し、筋分化過程においてde novo DNAメチル化が分化に重要な遺伝子発現制御を担っている可能性を示した。また、Rp58に認識されるプロモーターが効率にDNAメチル化を受けることを明らかにした。哺乳類におけるde novo DNAメチル化酵素にはDnmt3aおよびDnmt3bが知られており、これらの遺伝子をknock-outすると正常な発生が進まなくなることからde novo DNAメチル化は発生に必須であると考えられる。造血幹細胞においてDnmt3aをknock-outすると分化が障害されることが報告され、体性幹細胞の分化においてもde novo DNAメチル化が必須であることが示唆されているが筋前駆細胞における同様の報告はない。本研究では、さらに、DNMT3Aコンディショナルノックアウトマウスを用いて、DNAメチル化の筋サテライト細胞における筋再生を促す機能を解析し、Dnmt3aを欠損した骨格筋幹細胞ではCDK inhibitorであるp57Kip2が高発現しており細胞増殖が障害されていることを見出した。Dnmt3aはp57Kip2の発現調節を介して骨格筋幹細胞の増殖を制御し骨格筋の再生を制御する一因となっていると考えられ、エピジェネティックスレベルでの筋分化・再生の分子機序の一部を明らかにした。さらに、Rp58とDNAのメチル化の関係について研究を進めている。
1: 当初の計画以上に進展している
骨格筋幹細胞におけるDNAメチル化の意義を明らかにするため、骨格筋前駆細胞で発現するPax7あるいはPax3依存的にDnmt3a遺伝子を欠損するコンディショナルノックアウトマウスを作成し、筋再生の観点から研究を進めた結果、Dnmt3aを欠損した骨格筋幹細胞ではCDK inhibitorであるp57Kip2が高発現しており細胞増殖が障害されていることを見出した。Dnmt3aはp57Kip2の発現調節を介して骨格筋幹細胞の増殖を制御し骨格筋の再生を制御する一因となっていると考えられた。また、Rp58とDNAメチル化の関係についてゲノムワイドに解析を行った。
ゲノムワイドに筋分化におけるDNAメチル化の解析を行う。さらに、そのメチル化によって、遺伝子変動がどう変化するかを検討する。またその領域にDNAメチル化を誘導する特異的シークエンスがないか、さらにはそのシークエンスに結合する因子の探索を行う。またそのシークエンスを遺伝子編集にて削除し、DNAメチル化への影響とそれによる筋分化のフェノタイプを解析する。Rp58はその候補分子の一つであり、コンディショナルノックアウトマウスを作成することで、筋分化や筋再生におけるDNAメチル化の誘導における役割を詳細に解析する。
遺伝子改変マウス産仔数が当初計画よりも少なく、実験に使用可能な個体数を得るのに難渋を極めた。結果として本年度飼育可能であったマウス数は予定より少なくなり、また同マウスを用いて行う予定であった実験が行えなかったことにより、予定通りの予算執行ができなかった。
Rp58遺伝子改変マウスを継続飼育・繁殖させ、十分な数の同マウスを用いた実験、およびそれを用いた分子生物学的実験に必要な試薬購入のために使用する。
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すべて 雑誌論文 (9件) 学会発表 (22件) (うち国際学会 1件、 招待講演 5件)
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