| 研究課題/領域番号 |
15K15548
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
鬼頭 浩史 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40291174)
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| 研究分担者 |
杉浦 洋 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (40750477)
松下 雅樹 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (60721115)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 進行性骨化性線維異形成症 / ドラッグスクリーニング / 異所性骨化 / Id1 / ALK2 |
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| 研究実績の概要 |
進行性骨化性線維異形成症（fibrodysplasia ossificans progressiva : FOP）は骨形成タンパク（bone morphogenetic protein : BMP）の受容体であるALK2の活性型変異により発症し、全身の軟部組織に進行性の異所性骨化をきたす難病である。異所性骨化は外傷や手術侵襲などで急激に増悪するため、外科的治療の適応はなく、むしろ禁忌とされている。現在、進行性の異所性骨化を抑制する有効な治療法はない。我々は変異型ALK2強制発現ベクターおよびBMPシグナルの標的遺伝子であるId1プロモーターのレポーターベクターをマウス筋芽細胞株C2C12に導入して、ルシフェラーゼ活性にて薬効スクリーニングする系を確立した。この系に、1186種類の米国食品医薬品局（FDA）既認可化合物のライブラリー（Prestwick社）を添加し、ルシフェラーゼ活性の減弱する（Id1プロモーター活性を減弱させる）既存薬を網羅的に検索した。ファーストスクリーニングにてカットオフ値をvehcle比0.3以下とし、抗がん剤や抗生剤、免疫抑制剤など長期投与が困難な薬剤を除外してセカンドスクリーニングを行った。細胞増殖能の低下に基づくルシフェラーゼ活性の低下が危惧されたため、セカンドスクリーニングではMTSアッセイにより細胞増殖能も評価した。セカンドスクリーニングにて、細胞増殖が阻害されることなくルシフェラーゼ活性を下げた8種類の薬剤を候補薬として、サードスクリーニングを予定している。同時に、Cre-Loxシステムを用い、筋肉内に異所性骨化をきたすFOPモデルマウス（ALK2 Q107D）の確立に向けた研究も実施している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々はC2C12に変異型ALK2ベクター（ALK-R206H）、Renilla-luciferaseベクター（phRL-TK）、4タンデムId1プロモーターluciferaseベクター（IdWT4F-Luc）を遺伝子導入し、ルシフェラーゼ活性によりId1のプロモーター活性をスクリーニングする系を確立した。この系を用い、セカンドスクリーニングまで実施し、8種類の候補薬に絞り込んだ。以上より、27年度当初計画はほぼ、順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
8種類の候補薬に関し、サードスクリーニングにて濃度依存性の有無を検討する。最も有効な濃度依存性を示す候補薬1-3種類に絞り、Id1mRNAの発現をRT-PCRで、Id1タンパクの発現をWestern blotting法にて評価する。同様に、Id1の標的遺伝子である各種骨形成マーカー（アルカリフォスファターゼ、オステオカルシンなど）のmRNAおよびタンパクの発現を評価する。また、BMPシグナルで活性化する細胞内Smad1/5/8 のリン酸化抑制作用に関しても検討する。これらin vitroの研究により候補薬を1種類に絞り込み、動物モデルにおける骨形成抑制効果を検討する。動物モデルに関しては、ALK2 Q107Dだけでなく、crude BMPの筋肉内移植による異所性骨化モデルに関しても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験消耗品（試薬や培養液など）の使用は予定よりわずかに少なくなったことで、6,749円の残高が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度に実験消耗品として使用する予定である。
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