| 研究課題/領域番号 |
15K15613
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
河村 和弘 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (10344756)
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| 研究分担者 |
高江 正道 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (00621301)
吉岡 伸人 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (10468928)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 卵胞発育 / phosphodiesterase 5 / cGMP / 不妊治療 |
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| 研究実績の概要 |
PDE5抑制剤による顆粒膜細胞増殖、２次卵胞発育の証明: ３週齢マウス由来の胞状卵胞より単離した顆粒膜細胞を、Sildenafilにて前処理培養し、48時間培養したところ、対照群に比較し有意な細胞数の増加がみられた。さらに、Sildenafil前処理群では、各ウエルあたりのエストロゲン値も増加していたが、細胞あたりのエストロゲン値は増加しなかった。
10日齢マウス卵巣より単離した２次卵胞をFSHおよびSildenafilの存在下/非存在下で4日間培養したところ、後、卵胞径が対照群に比較し有意に増大した。卵胞の免疫染色では、Sildenafil前処理群の顆粒膜細胞でKi-67が強発現していた。10日齢マウス卵巣をFSHおよびSildenafilを用いて4日間培養し、培養後に固定して卵巣重量を測定したところ、卵巣重量が増加していた。
PDE5抑制剤を用いた卵巣刺激法のプロトコールの確立：顆粒膜細胞のFSH受容体の発現とFSH刺激による排卵数を調べ、FSH刺激に低反応な高齢患者モデルとして48-50週齢を決定した。この加齢マウスに対してSildenafilを投与し、その後、FSHとSildenafilを同時に投与してhCGにより排卵させ、排卵数が最大となる様な至適条件を決定した。Sildenafilを用いた卵巣刺激によって得られた卵子の受精能および発生能の正常性を調べるため、体外受精を行い受精率と胚盤胞到達率を測定したところ、Sildenafil非使用群と比較して差を認めなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成27年度に予定したマウスを用いた研究計画に従い、Sildenafilによる顆粒膜細胞増殖、２次卵胞発育促進効果が示された。また、Sildenafilを用いた卵巣刺激法のプロトコールの至適化を行うことができた。しかし、平成27年度に予定していた一部の実験に関しては、Sildenafil前処理群での細胞あたりのエストロゲン値や血中cGMP濃度を測定は、実験系を再構築する必要が生じ、Sildenafilを用いた卵巣刺激によって得られた卵子の正常性の解析はさらに追加の解析が必要となった。また、ヒト顆粒膜細胞や卵巣皮質を用いた試験はまだ施行できておらず、やや進捗が遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に予定した研究計画のうち、Sildenafil前処理群での細胞あたりのエストロゲン値が予想と反して増加しなかったため、エストロゲンの原料となるアンドロゲンを添加した系で再度検証する。また、10日齢マウス卵巣をFSHおよびSildenafilを用いて培養後の組織学的な卵胞分布の計測を行い、Sildenafilの卵胞発育促進効果をさらに実証する。Sildenafilの活性抑制効果をモニター可能とするため、血中cGMP濃度を測定したが、当初用いたELISA kitでは測定感度以下であったため、依り高感度のものを用いて再測定し、排卵数との相関を調べる。Sildenafilを用いた卵巣刺激によって得られた卵子の正常性をさらに検証するため、偽妊娠マウスに胚移植を行って、妊娠異常の有無、出生した子および胎盤の異常の有無を形態学的、組織学的に調べる。得られた子は交配して次世代まで飼育し、行動異常の有無、妊孕性について調べ、副作用の発生を検索する。これら一連の非臨床試験により、SildenafilがFSH刺激に低反応な卵巣の卵胞発育に有用であると判断された場合、不妊患者を対象とした比較対照試験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度に予定した研究計画のうち、マウス試験は既存の試薬、動物を用いて実施した。平成27年度予算はヒト顆粒膜細胞株の購入、ヒト卵巣を組織を用いた試験に必要な高額なSCIDマウスの購入、ホルモン値やcGMP測定のための高感度ELISA購入、Sildenafilを用いた卵巣刺激によって得られた卵子由来の胚移植後の胎盤・児の組織学的検査に使用予定であったが、研究計画がやや遅れ、ヒト顆粒膜細胞や卵巣を用いた試験、ホルモン値やcGMP測定、Sildenafilを用いた卵巣刺激によって得られた卵子の正常性の解析の一部は平成28年度に行うこととなり、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画を加速するため、H28年3月より新たに研究技術員を雇用して組織学的な卵胞分布の解析を行い、平成28年５月末までに完了する予定であり、その人件費として直接経費の一部を使用する。また、マウスによる試験で得られた結果をもとに、ヒト顆粒膜細胞や卵巣皮質を組織を用いた試験を8月までに完了する予定であり、細胞株・SCIDマウスの購入や培養に必要な試薬、器具を購入する経費に直接経費を充てる。また、Sildenafil前処理群での細胞あたりのエストロゲン値や血中cGMP濃度の測定のため、高感度ELISAを購入し、測定を8月までに完了する予定である。Sildenafilを用いた卵巣刺激によって得られた卵子の正常性の解析のため、胚移植に必要な偽妊娠マウス、組織検査に必要な試薬、器具に予算を使用し、8月末までに完了する予定である。
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