| 研究実績の概要 |
2次元培養と非接着培養皿による細胞凝集塊のDNAメチル化の網羅的解析を行うためには、可及的に2者の細胞の条件を合わせる必要があるので、ヒト皮膚由来線維芽細胞を用いて、一部はSkps用培養液（DMEM/F-12+bFGF+EGF+B27)の無血清培地で2次元培養を、一部は１％の寒天でプラスティックディッシュをコーティングした非接着性培養皿に、Skps用培養液で浮遊させた線維芽細胞を播種し、細胞凝集塊を形成させた。それぞれの培養開始後、1週ごとに4週目まで細胞の一部を回収し、MTT assay,BrdU取り込み, TUNEL法,を使用して細胞死や増殖が停止する時期の決定を行った。細胞死と増殖が停止する時期を決めたのちに、それぞれの細胞を4％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、一部はwhole mountで免疫染色を行い、一部はパラフィン包埋し、2 μｍの切片を作成し、これまで未分化マーカーとして報告されているさまざまな因子につき免疫染色を行った。これら因子につき、real time RTPCRを用いて、凝集塊総量の遺伝子発現の変化について定量的に観察した。また、ヒト間葉系幹細胞分化誘導試薬を用いて、脂肪、骨、軟骨への分化誘導効率を確認した。
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