| 研究課題/領域番号 |
15K15691
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
中浜 健一 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (60281515)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ギャップジャンクション / がん / 細胞間コミュニケーション / コネキシン４３ |
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| 研究実績の概要 |
本年度の計画はギャップジャンクションを介する分子の動きを可視化する事により、がん細胞と正常細胞との間の細胞間コミュニケーション樹立を確認する。それらの候補となる分子による正常細胞とがん細胞コミュニケーションの確立がもたらすがん細胞の形質変化を詳細に調べることである。今年度に得られた結果を下記に示す。
１、がん細胞としてC6グリオーマ細胞、正常細胞としてラット由来アストロサイトを用いることとし、培養を開始した。
２、C6グリオーマ細胞間ではギャップジャンクションが形成されないこと、アストロサイト間ではギャップジャンクションが形成されることをFRAP(Fluorescence Recovery after Photobleaching)法を用いた実験により確認した。
３、C6グリオーマ細胞にレトロウイルス法を用いてCx43を発現させ、恒常的にCx43を発現するC6グリオーマ(C6Cx43)を樹立し、免疫染色法にてCx43の発現を確認した。
４、アストロサイトとC6Cx43細胞間にギャップジャンクションが形成されることをFRAP法を用いた実験により確認した。
５、さらに、低分子化合物であるグルコースや核酸がギャップジャンクションを通過できるか否かを調べるため、CyAL-5 2-deoxyglucose optical probe(MW=853)およびAlexa Fluor 488-5-dUTP(MW=933.3)を購入し、細胞培養中に培地への添加を行ったが細胞内への取り込み量は少なく、満足の得られる結果ではなかった。現在は細胞内へ取り込ませるため様々な方法を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
がん細胞にCx43を恒常的に発現させた細胞株C6Cx43を樹立し、正常細胞であるアストロサイトとのコミュニケーションを確立させることができた。しかし当初考えていたグルコースや核酸のギャップジャンクションを介した動きを観察するに至っていない.これはグルコースや核酸の細胞内導入が当初考えていたよりも困難であったためである。また、Fucciシステムを使った細胞周期観察は再度ウイルスベクターの構築をする必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、非イオン性共重合体界面活性物質であるF-127、リポフェクタミンやエレクトロポレーションによるトレーサーの細胞内導入を試み、FRAPだけではなくパラシュート法により細胞間コミュニケーションの有無を明らかにしたい。この段階を超えることができるとがん細胞と正常細胞間のコミュニケーションが果たす役割が明らかになってくると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は予想を上回る技術的な困難があり、研究の進捗に遅れが生じたため当初の予算額との違いが生じた。来年度はこの遅れを取り戻すべく、集中的によりダイナミックに実験を進めていきたい。
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| 次年度使用額の使用計画 |
細胞培養による細胞間コミュニケーションに関する研究、特にグルコースと核酸の細胞間移動を証明するため様々な手法を駆使して実験を行う。また、マウスを用いたがん移植実験も同時に行い当初の計画を滞りなく遂行したい。
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