| 研究課題/領域番号 |
15K15741
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
宮本 洋二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (20200214)
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| 研究分担者 |
玉谷 哲也 徳島大学, 大学病院, 講師 (30274236)
高丸 菜都美 徳島大学, 大学病院, 助教 (40513031)
永井 宏和 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (50282190)
大江 剛 徳島大学, 大学病院, 助教 (60432762)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ヒト骨髄間葉系幹細胞 / マイクロアレイ解析 / イオンプレーティング法 |
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| 研究実績の概要 |
イオンプレーティング法を用いることによって、ガラスディッシュ表面にチタン、金およびステンレスをコーティングして、表面粗さや表面形状が同一で材質だけがことなる試料を作成した。これらディッシュ（チタン、金、ステンレス、ガラス）上で、ヒト骨髄間葉系幹細胞（hMSC-BM: Promo Cell No C-12974）を６時間培養し、RNAを回収した。cDNAのマイクロアレイを用いて、遺伝子の発現を解析した。遺伝子発現変化の網羅的解析はtoal RNAを逆転写してcDNAを作製後、Affymetrix社製 Gene Chip cDNAマイクロアレイキットを用いて解析し、発現変化を認めた候補遺伝子が確認できた。チタン上で２倍以上の発現変化を示した遺伝子を検索し、ガラスに対して78遺伝子、金に対して115遺伝子、ステンレスに対して115遺伝子を同定した。さらに、total RNAをTaqMan® cDNA Reverse Transcription (RT) Kit(Applied Biosystems)により逆転写し、ABI PRISM 7000 Sequence Detection SystemとTaqMan®Gene Expression AssaysによるリアルタイムPCR法を用いてmRNAレベルでの発現を確認中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ガラスディッシュ表面をチタン、金、ステンレスでコーティングして、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、マイクロアレイによる解析を行い、発現変化を認めた候補遺伝子が確認した。さらに候補遺伝子のmRNAレベルでの発現をリアルタイムPCR法にて確認した。本年度の計画では、タンパクを回収し、標的タンパクの発現確認までを予定していたが、細胞の増殖とガラスディッシュのコーティングに時間を要したが、順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
ディッシュ（チタン、金、ステンレス、ガラス）上で、ヒト骨髄間葉系幹細胞を６時間培養し、RNAを回収する。Affymetrix社製human miRNAマイクロアレイキット(V2)を用い、miRNAの発現を解析する。候補となったmiRNAをリアルタイムPCR法を用いて発現を確認する。
miRNAマイクロアレイ時と同様の条件で、各種ディッシュ上で培養したhMSC-BMからタンパクを回収し、Western Blotting法により標的タンパクの発現を検討する。このとき、標的タンパクの発現を大きく変化させた候補miRNAを選択し、リアルタイムPCRを用いて候補遺伝子の発現を確認し、候補mRNAに対する標的タンパクの発現確認を行う。また、候補miRNAの標的タンパクに対する抗体を用いて発現の確認を行う。さらに、ヒト間葉系幹細胞をターゲットとして遺伝子およびmRNA発現を解析するだけでなく、骨芽細胞を用いて同様の研究をすすめていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マイクロアレイ解析による候補遺伝子を確認したが、miRNA、タンパク発現の確認には至っておらず、次年度の課題とした。そのため、miRNA , Western Blotting法に使用する試薬・機器の購入ができていないためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
miRNAマイクロアレイを行う。また、各種ディッシュ上で培養したhMSC-BMからタンパクを回収し、Western Blotting法により標的タンパクの発現を検討する。miRNAとWestern Blotting法に使用する試薬・機器の購入を予定している。
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