| 研究課題/領域番号 |
15K15765
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
村上 伸也 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (70239490)
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| 研究分担者 |
山口 佳則 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20386634)
野崎 剛徳 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (30263304)
竹立 匡秀 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (60452447)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ラマンイメージング / 歯根膜細胞 / 分化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、ラマンイメージングを歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化過程の解析に応用し、同過程におけるハイドロキシアパタイト(HA)集積や分化関連分子群の発現、局在について経時的な解析を行っている。平成27年度の研究成果について以下に報告する。
我々はこれまでに、マウス骨芽細胞KUSA-A1の分化過程におけるHAの集積をラマンイメージングにて経時的に観察する手法を確立し、報告してきた。そこで、まず同手法をヒト歯根膜細胞に応用するために、解析条件の検討を行った。ラマンイメージング解析には自家蛍光の少ない基板上で細胞を培養する必要があるため、ヒト歯根膜細胞を石英ガラス基板上で培養したところ、10日前後で細胞が剥離し分化過程を観察するための長期の培養が困難であった。そこで、基板表面の細胞外基質処理について検討したところ、25ug/mL フィブロネクチン溶液にて前処理することにより、細胞培養を19日間程度まで延長することに成功するとともに、石灰化誘導培地を用いた分化誘導15日目にはアリザリンレッド染色陽性の石灰化ノジュールが観察された。なお、フィブロネクチンコートはラマンスペクトルに大きな影響を及ぼさないことを確認した。
一方で、ラマンイメージングと蛍光免疫染色法の組み合わせにより、HA集積とI型コラーゲン分子の局在の関連について解析するために、マウス骨芽細胞を用いて検討を行った。すなわち、マウス骨芽細胞を石灰化誘導培地にて培養し、ラマンイメージングにてHAを観察後、同部位のI型コラーゲンの局在を蛍光免疫染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。その結果、多くのHAが観察された部位のコラーゲン線維は均等にかつ網目状に分布していたが、HAの少ない部位ではコラーゲン線維が少なく不均一であった。
今後、ヒトおよびマウス歯根膜細胞の分化過程について、上記条件をもとに解析を継続する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト歯根膜細胞のラマンイメージング解析を行うための条件が明らかになり、観察を開始する準備が整った。一方で、HAの形成初期における骨組織関連細胞外基質であるタイプIコラーゲンの局在について解析を実施したため、研究実施計画をおおむね遂行したと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
フィブロネクチンコートした石英ガラス上にて歯根膜細胞を長期に培養することにより、硬組織形成細胞への分化誘導が可能になったため、同条件にてラマンイメージング解析を行い、経時的なHAの集積を解析するとともに、タイプIコラーゲンの分布を蛍光免疫染色にて明らかにする。Heterogeneousな細胞群であるヒト歯根膜細胞あるいはクローン化した複数のマウス歯根膜細胞株を石灰化誘導培地にて共培養することにより、分化度の異なる細胞集団における分化過程をsingle cellレベルで詳細にイメージング解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究を遂行するにあたり、主に試薬およびプラスチック器具等の消耗品の購入のために研究費を使用し、概ね予定通りの執行を行うことが出来たが、年度末に行った実験の一部が次年度にまたがることになり、若干の次年度使用額が生じることになった
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画に変更はなく、H28年度に繰り越した研究費を含めて、予定通り研究費を執行し、研究を遂行する。
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