| 研究課題/領域番号 |
15K15775
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
齋藤 俊行 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (10170515)
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| 研究分担者 |
林田 秀明 長崎大学, 病院(歯学系), 講師 (20238140)
古堅 麗子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (90253674)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 歯周病 / オートファジー |
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| 研究実績の概要 |
各種神経細胞に歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalis由来LPSおよび大腸菌由来LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率に違いがあるかどうかを検証した。LPSの種により生存率や増殖率に有意な差は認めなかった。各種LPS添加後、経時的に回収した細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成した。Real-time RT-PCR法でTNF-α、IL-6、IL-1等サイトカイン、アディポネクチン, レジスチン, レプチン等アディポカインのmRNA量を定量し比較したところ、炎症に関係するTNF-αの発現が有意に高くなっていることを確認した。アディポカインの産生量については、培養条件により各回ごとに結果が一定しないため、再度研究方法を含めて検討中である。
各種LPSによる刺激後、経時的に回収した培養上清中各種サイトカイン、アディポカインの産生量をELISA法で定量し、各種細胞における濃度依存的および経時的な産生の違いについて解析した。歯周病菌由来LPSでは、大腸菌と同じ濃度では、有意な結果が得られないことが多く、作用として弱いことが示唆された。
各種LPS添加後、経時的に回収した細胞をアディポネクチン, レジスチン, レプチン等アディポカインおよびATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いた Western blotting 法により発現の違いを解析した。高血糖培地での培養後の細胞とも比較した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
各種神経細胞に歯周病原菌であるPorphyromonas gingivalis由来LPSおよび大腸菌由来LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率に違いがあるかどうかを検証した。アディポカインについては、培養条件により結果が一定しないため、再度方法を含めて検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
伝達抑制抗体であるJNK、MAPK各種抗体（SP600125、LY294002、PD98059、SB203580）による処理後に各種LPSを添加後、経時的に回収した培養上清中のTNF-α、IL-6、IL-1等産生量をELISA法にて、また細胞中レベルをWestern blot 、Real-time PCRで各種サイトカイン、各種アディポカインのmRNA量を定量し比較することで、シグナル伝達経路の違いについて解析する。
レプチンおよびレプチン受容体siRNAを作成し、神経細胞と歯肉線維芽細胞に遺伝子導入後、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証する。各種LPSで刺激後の各種サイトカイン、アディポカイン産生をELISA法およびWestern blot、Real-time PCRにて比較し、さらに高血糖培地で培養した細胞でも同様に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
神経細胞の培養についてはなかなかうまくいかず、細胞増殖を軌道に乗せるまでに予想以上に時間がかかったため、実験自体を進めることができなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
神経細胞に各種LPS添加後、経時的に回収した細胞をアディポネクチン, レジスチン, レプチン等アディポカインおよびATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いた Western blotting 法により発現の違いを解析する。高血糖培地での培養後の細胞とも比較する。
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