| 研究課題/領域番号 |
15K16131
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
野口 実穂 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 主幹研究員(定常) (40455283)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 老化様増殖停止 / オートファジー / 線維芽細胞 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度は、不死化したヒト正常線維芽細胞であるBJ-5ta細胞を用い、X線照射を受けた線維芽細胞で老化並びにオートファジーが誘導されるか否かについての実験を行った。
まず、X線照射後のBJ-5ta細胞の増殖曲線を作成した。X線10Gyでは照射後7日間は細胞数の増加がみられなかったが、その後急激に増殖した。一方、X線20Gyでは7日以降も細胞数の増加がみられなかったことから、細胞周期が停止していることが推測された。続いて、X線20Gy照射後の細胞周期が停止した細胞で老化が誘導されているか否かをβガラクトシターゼ染色にて調べた。照射後4日目では老化が誘導された細胞は全細胞の30％程度であったが、8日後には照射を受けたほぼすべての細胞で老化が誘導されていることを確認した。さらに、この状態で30日以上生存し続けることも確認した。
さらに、照射によりオートファジーの活性が上昇するか否かを調べる実験を行った。まずはじめに、バキュロウイルスを用いてオートファジー誘導時に発現が増加するLC3遺伝子を細胞内に導入し、オートファゴソーム自身を発光させることでオートファジーのモニタリングを行う方法を試みたが、BJ-5ta細胞では細胞内にバキュロウイルスが導入されず、オートファゴソームの発光を検出することができなかった。そのため、オートファゴソームを特異的に染色するCyto-ID試薬を用いてオートファジーのモニタリングを行った。さらに、X線照射後のLC3タンパク質の発現をウェスタンブロッティングにて調べる実験も合わせて行い、現在も継続して照射後のオートファジー活性を調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
X線未照射でのオートファジー活性が非常に高く、薬剤を用いてオートファジーを誘導させた場合と同程度の活性を示したことから、未照射時のオートファジーの活性を下げるための条件の検討に時間がかかり、計画よりもやや遅れてしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度から引き続き、X線照射後のオートファジーの活性をCyto-IDによるオートファゴソームの可視化によるモニタリング、ならびにウェスタンブロッティングによるLC3タンパク質の発現量の変化により調べる。これらと並行して、X線照射により細胞内で異常なタンパク質が増加するか否かをオートファジーによるタンパク質分解の目印となるアダプタータンパク質（p62やリン酸化p62タンパク質）をウェスタンブロッティングにより調べ、目標の一つである「放射線照射によるタンパク質の損傷によりオートファジーが活性化するのか」についてとりまとめを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
すべての助成金は29年度に支払われてるが、育児休業のための期間延長を行い31年度まで期間が延長されており、次年度以降に使用できる金額を残す必要があったため次年度使用額が生じた。そのため、本年度の請求は行っていない（0円）。
次年度使用額は細胞培養のための培地、複数の抗体や泳動に必要なゲル、学会参加のための費用に使用する予定である。
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