ネコにおける有機ハロゲン化合物の代謝機構解明と甲状腺機能の影響評価

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K16132
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 水川 葉月 北海道大学, 獣医学研究科, 助教 (60612661)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: ネコ / PBDEs / 脱臭素化 / 甲状腺ホルモン / in vivo / 甲状腺機能亢進症 / 生化学マーカー

研究実績の概要

本申請研究では、社会的関心の高いペット動物の化学物質汚染と健康リスクに焦点を当て、とくにネコ体内に残留する有機ハロゲン代謝物の体内レベルや体内動態、代謝排泄能の解明を目的とし、甲状腺機能障害に及ぼす影響の検証を試みる。
本年度は、ポリ臭素化ジフェニルエーテル（PBDEs）の体内変化を明らかにするために、昨年度より継続して実験動物として飼育されているネコにPBDEsの異性体の一種であるBDE209を投与し、in vivoでの動態試験を行った。供試したネコから経時的に血清・糞尿を採取し、分析まで‐20℃で保存した。投与開始より54週後の飼養期間終了時に獣医師による甲状腺機能亢進症の診断を行った。その結果、食欲増進や体重減少、活動増加といった臨床症状は認められなかったが、PBDE投与群でのみ膝窩リンパ節の蝕知が認められた。飼養期間終了後には、臓器・組織を採取し、‐20℃もしくは‐80℃にて保存した。経時採血した血清を用い、甲状腺ホルモン（総T4、遊離T4、総T3、遊離T3、リバースT3）濃度を分析したところ、両群に有意な差は認められず、また値も正常範囲内であった。また、24週目には肝酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）がPBDE投与群で有意に高値を示したが、その他の肝酵素や腎酵素に有意な差はなく、他の採血週においても差は認められなかった。投与開始後0.5h、1h、3h、6h、20h、6週目、12週目、18週目、24週目、30週目、36週目、42週目、48週目、54週目の血清中PBDEs濃度を測定したところ、体内に取り込まれたBDE209は18週目まで増加し、その後24週目にかけて大きく減少、以降は定常状態を示した。また、投与6時間目からBDE209の脱臭素化であるNona-BDEsが、12週目からOcta-BDEsが確認された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の目的であるin vivo PBDE投与試験について、計画通り終了し、様々な臓器組織を得ることが出来た。また、獣医師による臨床診断や、血清中バイオマーカー（肝酵素、腎酵素、ステロイド等）測定も実施した。また、採取した臓器・組織を供試して、ネコ体内のPBDEsおよびその代謝物濃度について、測定を開始している。また、第I相水酸化酵素であるシトクロムP450や第II相抱合酵素であるグルクロン酸抱合酵素、硫酸抱合酵素の活性測定や遺伝子発現量解析に向けた前処理を実施しており、測定を進める準備が整っている。さらに、甲状腺ホルモン濃度の分析についても分析を行う準備が整っている。

今後の研究の推進方策

in vivo投与試験後のネコの血液、肝臓、胆汁、尿中の水酸化代謝物や抱合体化物を分析し、親化合物との関係を解析して代謝能力を検証し、PBDEsの代謝排泄能を評価する。PBDEsの抱合体化物は、脱抱合体化させ蛍光検出器や高速液体クロマトグラフィー・質量分析計（HPLC-MS）を用いて分析する。ヒト尿中からPBDEsの代謝物として考えられるブロモフェノール抱合体（グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体）を分析した研究が報告されており、ペットの組織中抱合体化物の分析には既報を適用する。さらに、in vivo試験により得られたネコの肝臓を供試して第I相、第II相反応に関わる薬物代謝酵素（CYPs）や抱合酵素（UDP-GT、GST、SULT）の活性測定や遺伝子を抽出・クローニングして配列を決定し、代謝機構を解明するとともに、甲状腺機能撹乱メカニズムの解明とリスク評価のための科学的根拠を提示する。酵素活性は薬物代謝酵素のアッセイ法として公知のAROD法や、抱合酵素のUDPGT、GST活性測定キット（UGT Glo assayやGST assay kit）を用いて算出する。
OH-PCBsやOH-PBDEsは、生体内で甲状腺ホルモン輸送タンパク（TTR）に結合し残留している。ネコにおいてOH-PCBsの残留組成が他の陸棲哺乳類と異なることから、第I相・第II相代謝能のみならず、甲状腺ホルモン輸送タンパクへの結合にも種差があると考えられる。そこで、ネコおよび実験動物（マウスやラット、イヌ）の肝臓組織を用いて、甲状腺ホルモン輸送タンパクとの競合結合試験を行い、結合能を生物種差によって評価する。

研究成果

• [国際共同研究] カセサート大学(タイ)
  • 国名: タイ
  • 外国機関名: カセサート大学
• [国際共同研究] モンゴル国立農業大学(モンゴル)
  • 国名: モンゴル
  • 外国機関名: モンゴル国立農業大学
• [雑誌論文] 非実験動物における化学物質代謝能の特徴と種差 Characterization of species differences of xenobiotic metabolism in non-experimental animals (2017)
  • 著者名/発表者名: 水川葉月、池中良徳、筧麻友、中山翔太、石塚真由美
  • 雑誌名: YAKUGAKU ZASSHI 巻: 137 ページ: 257-263
  • DOI: 10.1248/yakushi.16-00230-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of Equine Cytochrome P450: Role of CYP3A in the Metabolism of Diazepam. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakayama SMM, Ikenaka Y, Hayami A, Mizukawa H, Darwish WS, Watanabe KP, Kawai YK, Ishizuka M.
  • 雑誌名: Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 巻: 39 ページ: 478-487
  • DOI: 10.1111/jvp.12303.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The African hedgehog (Atelerix albiventris): low phase I and phase II metabolism activities. (2016)
  • 著者名/発表者名: Saengtienchai A, Ikenaka Y, Bortey-Sam N, Jermnark U, Mizukawa H, Kawai YK, Nakayama SMM, Ishizuka M.
  • 雑誌名: Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol. 巻: 190 ページ: 38-47
  • DOI: 10.1016/j.cbpc.2016.08.005.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 代謝酵素の動物種差 (2017)
  • 著者名/発表者名: 石塚真由美、中山翔太、水川葉月、池中良徳
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 化学物質の汚染環境に生きる野生動物の適応戦略 (2016)
  • 著者名/発表者名: 石塚真由美、中山翔太、水川葉月、池中良徳
  • 学会等名: 一般社団法人日本環境化学会25周年記念講演会：「環境化学の今、そして未来へ－環境化学からの提言－」
  • 発表場所: 発明会館地下ホール、東京都港区
  • 年月日: 2016-11-16 – 2016-11-16
  • 招待講演
• [学会発表] Characteristic for biotransformation of polychrolinated biphenyls in cats (2016)
  • 著者名/発表者名: Hazuki Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Hiroyuki Nishikawa, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Kohki Takaguchi, Shinsuke Tanabe, Mayumi Ishizuka
  • 学会等名: The 7th SETAC World Congress/37th SETAC North America Annual Meeting
  • 発表場所: Rosen Shingle Creek, Orlando, FL, USA
  • 年月日: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • 国際学会
• [学会発表] Contamination status of organohalogen compounds and their hydroxylated metabolites in pet cats and dogs: effects on thyroid hormones homeostasis (2016)
  • 著者名/発表者名: Kei Nomiyama, Yasuo Yamamoto, Hazuki Mizukawa, Mitsuyoshi Takiguchi, Akifumi Eguchi, Shouta M.M. Nakayama, Yoshinori Ikenaka, Mayumi Ishizuka, Tatsuya. Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • 学会等名: The 7th SETAC World Congress/37th SETAC North America Annual Meeting
  • 発表場所: Rosen Shingle Creek, Orlando, FL, USA
  • 年月日: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • 国際学会
• [学会発表] Cross omics analysis for PCBs toxicity in the dog brain -Effect of mitochondria function- (2016)
  • 著者名/発表者名: Kohki Takaguchi, Kei Nomiyama, Lauan Maria Claret, Momoko Kusaki, Jean Yoo, Hazuki Mizukawa, Hisato Iwata, Tatsuya Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • 学会等名: The 7th SETAC World Congress/37th SETAC North America Annual Meeting
  • 発表場所: Rosen Shingle Creek, Orlando, FL, USA
  • 年月日: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • 国際学会
• [学会発表] In vivo analysis of PCB metabolic capacities and effects on the thyroid hormone in cats (2016)
  • 著者名/発表者名: Hazuki, Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Hiroyuki Nishikawa, Kohki Takaguchi, Aksorn Saengtienchai, Tsend-ayush Sainnoxoi, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Shinsuke Tanabe, Mayumi Ishizuka
  • 学会等名: The 9th International PCB Workshop
  • 発表場所: Kobe International Conference Center, Kobe, Japan
  • 年月日: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • 国際学会
• [学会発表] Toxicological assessment of PCBs and OH-PCBs in the brain of dogs using metabolomics approach (2016)
  • 著者名/発表者名: Kei Nomiyama, Kohki Takaguchi, Akifumi Eguchi, Hazuki, Mizukawa, Jean, Yoo, Saya, Tamura, Tomoko, Oshihoi, Hisato, Iwata, Tatsuya, Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • 学会等名: The 9th International PCB Workshop
  • 発表場所: Kobe International Conference Center, Kobe, Japan
  • 年月日: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • 国際学会
• [学会発表] Disruption of mitochondrial functions by PCB exposure in the dog brain: Toxicological assessment using cross omics (2016)
  • 著者名/発表者名: Kohki Takaguchi, Kei Nomiyama, Akifumi Eguchi, Lauan Maria Claret, Momoko Kusaki, Jean Yoo, Hazuki Mizukawa, Hisato Iwata, Tatsuya Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • 学会等名: The 9th International PCB Workshop
  • 発表場所: Kobe International Conference Center, Kobe, Japan
  • 年月日: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • 国際学会
• [学会発表] 野生げっ歯類の殺鼠剤の抵抗性メカニズムと非対象動物に対する毒性メカニズム (2016)
  • 著者名/発表者名: 石塚真由美、中山翔太、水川葉月、池中良徳
  • 学会等名: 日本哺乳類学会2016年度大会「企画シンポジウム：野生動物が関わる問題にどのように対応するか？～基礎研究を応用した解決への取り組み～」
  • 発表場所: 筑波大学、つくば市、茨城県
  • 年月日: 2016-09-23 – 2016-09-26
• [学会発表] The effect of environmental pollutants to pet animals ~Level and effects of Persistent organic pollutants (POPs) to domestic cat~ (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsend-ayush Sainnokhoi, Hazuki Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Aksorn Saengtienchai, Shinsuke Tanabe, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Mayumi Ishizuka
  • 学会等名: The 4th Sapporo Summer Seminar for One Health (SaSSOH)
  • 発表場所: Hokkaido University, Sapporo, Japan
  • 年月日: 2016-09-20 – 2016-09-21
  • 国際学会
• [学会発表] UGT2Bサブファミリーに着目した食肉目におけるグルクロン酸抱合能の動物種差解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 近藤誉充、池中良徳、中山翔太、水川葉月、Aksorn Saengtienchai、Yared Beyene、坂本健太郎、和田昭彦、服部薫、三谷曜子、田辺信介、野見山桂、石塚真由美
  • 学会等名: 平成28年度内外環境応答・代謝酵素研究会
  • 発表場所: 静岡県立大学薬学部、静岡市、静岡県
  • 年月日: 2016-09-17 – 2016-09-18
• [学会発表] 野生動物及び実験動物におけるグルクロン酸抱合酵素の動物種差解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 近藤誉充、池中良徳、中山翔太、水川葉月、Aksorn Saengtienchai、Yared Beyene、坂本健太郎、和田昭彦、服部薫、三谷曜子、田辺信介、野見山桂、石塚真由美
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 日本大学生物資源科学部、藤沢市、神奈川県
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [学会発表] 犬と猫の慢性腎臓病における尿細管周囲毛細血管の変化 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中村麗菜、矢吹 映、市居 修、水川葉月、横山 望、大和 修
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 日本大学生物資源科学部、藤沢市、神奈川県
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [学会発表] Metabolic capacities of polychlorinated biphenyls (PCBs) in cats and dogs (2016)
  • 著者名/発表者名: Hazuki Mizukawa, Kei Nomiyama, Shinsuke Tanabe, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama,Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Mayumi Ishizuka
  • 学会等名: 8th International Toxicology Symposium in Africa
  • 発表場所: Giza, Egypt
  • 年月日: 2016-08-29 – 2016-08-31
  • 国際学会
• [学会発表] クロスオミックスによるイヌ脳の PCBs 毒性評価（Cross omics analysis for PCBs toxicity in the dog brain） (2016)
  • 著者名/発表者名: 髙口倖暉、野見山桂、Lauan Maria Claret、Yoo Jean、水川葉月、岩田久人、国末達也、田辺信介
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • 発表場所: 北里大学、東京都港区
  • 年月日: 2016-07-28 – 2016-07-29
• [学会発表] ハリネズミは化学物質高感受性種？ African hedgehog (Atalerix albiventris)で観察された低薬物代謝能 (2016)
  • 著者名/発表者名: アクソルン サエンティエンチャイ、池中 良徳、ネスタ サム、ウスマ ジャムナーク、水川 葉月、中山 翔太、石塚 真由美
  • 学会等名: 第43回日本毒性学会学術年会
  • 発表場所: ウインクあいち、名古屋、愛知
  • 年月日: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [学会発表] ポリ塩化ビフェニル（PCBs）のin vivo暴露によるネコの異物代謝解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • 著者名/発表者名: 水川 葉月、前原 美咲、横山 望、市居 修、滝口 満喜、野見山 桂、西川 博之、池中 良徳、中山 翔太、高口 倖暉、田辺 信介、石塚 真由美
  • 学会等名: 第43回日本毒性学会学術年会
  • 発表場所: ウインクあいち、名古屋、愛知
  • 年月日: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [学会発表] UGTの動物種差 (2016)
  • 著者名/発表者名: 石塚 真由美、中山 翔太、水川 葉月、池中 良徳
  • 学会等名: 第43回日本毒性学会学術年会
  • 発表場所: ウインクあいち、名古屋、愛知
  • 年月日: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [学会発表] ネコにおけるポリ塩化ビフェニル（PCBs）の異物代謝機構解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • 著者名/発表者名: 水川葉月、前原美咲、横山望、市居修、滝口満喜、野見山桂、西川博之、池中良徳、中山翔太、高口倖暉、田辺信介、石塚真由美
  • 学会等名: 第25回環境化学討論会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ、新潟
  • 年月日: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [学会発表] 有機ハロゲン化合物によるコンパニオンアニマルの汚染実態と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • 著者名/発表者名: 野見山 桂、山本 恭央、水川 葉月、江口 哲史、滝口 満喜、中山 翔太、池中 良徳、石塚 真由美、国末 達也、田辺 信介
  • 学会等名: 第25回環境化学討論会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ、新潟
  • 年月日: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [学会発表] メタボローム解析を用いたPCBsによるイエネコの毒性影響評価 (2016)
  • 著者名/発表者名: 西川博之、野見山桂、水川葉月、横山望、市居修、滝口満喜、石塚真由美、池中良徳、中山翔太、江口哲史、国末達也、田辺信介
  • 学会等名: 第25回環境化学討論会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ、新潟
  • 年月日: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [学会発表] クロスオミックスによるイヌ脳へのPCBs毒性評価：ミトコンドリア機能へ及ぼす影響解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 高口 倖暉、野見山 桂、Lauan Maria Claret、草木 桃子、Yoo Jean、水川 葉月、岩田 久人、国末 達也、田辺 信介
  • 学会等名: 第25回環境化学討論会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ、新潟
  • 年月日: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [学会発表] メタボロミクスアプローチを用いたイヌ脳へのOH-PCBs毒性機序の解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 野見山 桂、高口 倖暉、江口 哲史、水川 葉月、Yoo Jean、田村 沙弥、忍穂井 智子、岩田 久人、国末 達也、田辺 信介
  • 学会等名: 第25回環境化学討論会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ、新潟
  • 年月日: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [備考] 北海道大学大学院獣医学研究院毒性学教室HP
  • URL: http://tox.vetmed.hokudai.ac.jp/
• [備考] 北海道大学大学院獣医学研究院毒性学教室Facebook
  • URL: https://www.facebook.com/tox.vetmed.hokudai/