| 研究課題/領域番号 |
15K16562
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
山口 亜利沙 (宮川亜利沙) 高知大学, 医学部, 日本学術振興会 特別研究員 (90553157)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | プロテオミクス / 分子アッセンブリー |
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| 研究実績の概要 |
オルガネラ膜上では 、受容体や輸送体など機能分子がアッセンブリー(会合から生まれる集合体)を形成することで、シグナル伝達や物質輸送を駆動している。よって、生命現象を分子レベルで解明するには、オルガネラ膜上分子アッセンブリー構造とその形成メカニズムを明らかにすることが求められている。しかし、従来技術では、生きている細胞内で、どのような分子が会合し集合体を形成しているかを解析することができない。本研究では、申請者が独自に開発した「HRP 発現型・高特異性 EMARS 法」を用いて、生細胞のオルガネラ膜上分子アッセンブリーを明らかにすることを目的とし、各種オルガネラ膜上分子アッセンブリー同定法を確立しようとした。
本年度は、細胞内にてEMARS法が適用可能か否かを解析するため、小胞体あるいはゴルジにHRP融合タンパクを発現させ、EMARS反応の条件を検討した。具体的には、小胞体保持シグナルであるKDELをHRPに付加したHRP-KDEL配列、およびゴルジに存在する酵素であるβ1,4- galactosyltransferase1を付加したβ4GALT1-HRP配列を組み込んだベクターを作製した。これらをHeLa細胞に導入・発現させ、EMARS反応を行った。その結果、発現したHRP-KDELあるいはβ4GALT1-HRPは、小胞体マーカー（calnexin）あるいはゴルジマーカー（GM130）と共局在し、さらにはEMARS反応による標識ラベルであるFluoresceinとも共局在していた。よって、細胞内オルガネラにおいてもEMARS法が適用可能であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々が新規開発したEMARS法は、細胞表面の膜上にのみ使用されてきた。本年度は、EMARS反応に必要なHRPをオルガネラに発現させ、EMARS法の条件を検討することにより、各種オルガネラ膜における高特異性EMARS反応の至適化が達成された。これにより、細胞内においてもEMARS法が適用可能であることを明らかにした。本条件を用いれば、細胞内の会合分子を同定できる段階にきており、これまで明らかにされなかったオルガネラ上の機能分子群の解明につながることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
各種オルガネラにHRPを発現させた細胞に、チラミド-FITCを添加し、本年度決定した条件にて高特異性 EMARS反応を行う。続いて、抗 FITC 抗体セファロースを用いて精製・濃縮した後、トリプシンにて消化したペプチド断片を LC－MS/MS 質量分析を用いて同定する予定である。同定された分子について、UniProt 等のデータベースを利用して細胞内局在が既知であるかを調査することにより、高特異性EMARS法の有効性を確認する。さらに、既知分子について膜内配置が明らかとなっているものについて、膜内のどの分子が同定されているかを解析する。膜外として同定されている分子、あるいは各オルガネラにおいて新規に同定された分子に関して、当該分子と HRP融合タンパク質を細胞内に導入し、共焦点顕微鏡を用いてその局在を解析する。局在が当該オルガネラであれば、新規オルガネラ分子としてデータベースを構築する予定である。
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