| 研究課題/領域番号 |
15K16562
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
山口 亜利沙 (宮川亜利沙) 高知大学, 医学部, 日本学術振興会 特別研究員 (90553157)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | プロテオミクス / 分子アッセンブリー |
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| 研究実績の概要 |
従来技術では、生きている細胞内で、どのような分子が会合し集合体を形成しているかを解析することができなかったため、本研究では、申請者が独自に開発した「HRP 発現型・高特異性 EMARS 法」を用いて、生細胞のオルガネラ膜上分子アッセンブリーを明らかにすることを目的とし、各種オルガネラ膜上分子アッセンブリー同定法を確立しようとした。
細胞内にてEMARS法が適用可能か否かを解析するため、小胞体あるいはゴルジにHRP融合タンパクを発現させ、EMARS反応の条件を検討した。具体的には、小胞体保持シグナルであるKDELをHRPに付加したHRP-KDEL配列、およびゴルジに存在する酵素であるβ1,4- galactosyltransferase1を付加したβ4GALT1-HRP配列を組み込んだベクターを作製した。これらをHeLa細胞に導入・発現させ、EMARS反応を行った。その結果、発現したHRP-KDELあるいはβ4GALT1-HRPは、小胞体マーカー（calnexin）あるいはゴルジマーカー（GM130）と共局在し、さらにはEMARS反応による標識ラベルであるFluoresceinとも共局在していた。よって、細胞内オルガネラにおいてもEMARS法が適用可能であることが明らかとなった。また、EMARS反応を触媒する酵素について検討した。これまでEMARS反応の触媒酵素としてHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用していたが、HRPは細胞質では活性発現しないので、HRPと同様の酵素活性をもつAPEX（アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）の使用を検討した。その結果、APEXによってもEMARS反応が可能であることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
EMARS反応に必要なHRPをオルガネラに発現させ、EMARS法の条件を検討することにより、各種オルガネラ膜における高特異性EMARS反応の至適化が達成された。これにより、細胞内においてもEMARS法が適用可能であることを明らかにした。さらに、EMARS反応の触媒酵素としてのHRPに加え、APEXも使用可能であることが明らかとなり、より細胞内オルガネラの適用範囲が広がった。
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| 今後の研究の推進方策 |
各種オルガネラにHRPまたはAPEXを発現させた細胞に、チラミド-FITCを添加し、本年度決定した条件にて高特異性 EMARS反応を行う。続いて、抗 FITC 抗体セファロースを用いて精製・濃縮した後、トリプシンにて消化したペプチド断片を LC－MS/MS 質量分析を用いて同定する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年6月末まで育児休暇をとっており、その後２ヶ月間短時間勤務であったため、研究期間が短かった。次年度の使用計画として、この間５ヶ月の使用計画に準ずるものとする。
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