| 研究課題/領域番号 |
15K18335
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
川口 将史 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (30513056)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 生殖前隔離 / 行動生態学的解析 / c-fos / 神経活動 |
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| 研究実績の概要 |
ヨシノボリを通年で飼育し、日照時間・水温・給餌量を季節ごとに変動させた。その結果、冬に相当する時期に水温を10℃まで下げた雌個体だけが、徐々に腹部に膨らみが観察できるようになった。今後、繁殖期までに卵黄が蓄積できるかどうかは、経時的な観察を要する。
巣作りしたヨシノボリ雄の水槽の前に別の水槽に入れた雌を提示した結果、同種の雌には求愛様行動、別種の雌には威嚇行動を示したことから、ヨシノボリの雄は視覚情報だけでも雌の種を識別できることが示唆された。行動に伴う神経活動をc-fosを指標として組織学的に可視化した結果、ガラス越しの求愛様行動は自然な求愛行動に比べて、嗅覚に関わる終脳背側野後部での活動が見られない以外は活動の分布が類似しており、求愛に関わる神経活動は、視覚入力のみによって惹起できることが示唆された。そこで次に、ヨシノボリの雌から型を取った模型を作成し、体表模様の改変による雄の反応の変化を観察しようとしたが、同種の雌の模型に対しても雄は威嚇行動を示した。おそらく、我々が気付かない細かな違いを模型では再現できていないと考えられる。
これまでに、c-fosを指標として行動に伴う神経活動を可視化する手法はすでに確立していたが、ヨシノボリの脳アトラスが存在しないため、活動が見られた領域の同定が進んでいなかった。しかし平成27年度は、名古屋大学の山本直之教授のご協力の下、ヨシノボリの脳から作成した切片を基に、神経核の同定を行うことができた。特に終脳領域の区域が明瞭になり、ヨシノボリの求愛あるいは威嚇行動に伴って、視覚情報に関わる終脳背側野外側部が活動していたことが判明した。また、視索前野から下垂体にかけて、求愛行動で強く活動する領域が見つかった。特に、求愛行動に伴って下垂体や視床下部で見られた活動の分布パターンは、エストロゲン受容体aの発現パターンに類似していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
繁殖サイクルの調節に水温が関わっている可能性が示唆できたことは、非常に価値が高い。実験水槽内で繁殖サイクルを回すことが可能になれば、研究室で孵化させた個体の繁殖行動を観察したりできるようになる。また、人工授精の条件も、ある程度同定することができた。人工授精の手法が確立できれば今後、種間で人工授精を行って受精から胚発生が正常に進むか、成長後に繁殖が可能かどうかを確認することで、生殖後隔離が確立しているのかを明らかにしていくことができる。もし生殖後隔離が確立していないとすれば、ヨシノボリの種分化は、生殖前隔離だけで維持されていることがわかる。
ヨシノボリの雄は視覚情報だけでも雌の種を識別できることが示唆できた。自然な求愛状態では、雌が巣に入った後の行動に伴う神経活動なども含めて観察されてしまうが、ガラス越しの求愛では、最初の識別から求愛の開始に関わる神経活動だけを調べることができるため、識別に関わる神経回路の同定に向けて、今後の解析を有利に進めることができるだろう。また、神経ペプチドや神経伝達物質関連因子など、神経マーカー因子の発現パターン解析が進んだ結果、エストロゲン受容体aのように、求愛行動に伴う活動パターンに類似した分布パターンを示す因子が見つかりつつある。今後、c-fosと神経マーカー因子の二重in situ hybridizationを行って包含関係を確認する他、神経伝達物質に対する阻害剤を雄の脳内に投与して行動の変化を観察することで、行動に伴って活動した神経回路がどのような素子を含むのかを明らかにしていきたい。
以上のように平成27年度は、今後の研究に必要な基本技術、基盤情報の整備を進める事ができたため、概ね順調に進展したと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度の行動生態学的解析では、ヨシノボリ雌から作成した模型は雄に威嚇されてしまったので、今年度は生きたヨシノボリの雌に直接刺青を施し、体表模様の改変によって雄の求愛・威嚇行動が変化するかどうかを観察する。刺青を施すためのタグはすでに購入済みである。また、人工授精の条件を確定し、異種間での受精が可能かどうかを検討する。
平成27年度の解析から、視覚情報の処理に関わる脳領域の活動が観察された。そこで本年度は、この脳領域に神経トレーサーを注入し、視覚情報の処理の後、脳の中のどの領域に情報が伝達されているのかを明らかにする。これにより、今まで点として活動が確認されていた領域同士を線で結び、求愛行動・威嚇行動における脳の中の情報の流れを明らかにしていく。
ヨシノボリの脳切片で二重in situ hybridizationを行うための系を確立する。すでに本研究室で、マウスの脳切片で二重in situ hybridizationを行うための系は確立しつつあるので、この系をヨシノボリに適用し、改善する。これによってc-fosの発現パターンと関連性のある神経マーカー因子が同定できれば、ヨシノボリの雄の脳内にこの因子の阻害剤を投与し、雄の行動の変化を観察する。以上の解析により、行動に伴って活動した神経回路がどのような素子を含むのかを明らかにしていく。
また、人工授精から実験水槽内での生育・繁殖サイクルを確立する目処がたったため、受精卵への薬剤インジェクションのための系も確立したい。CRISPR/Cas9により非モデル動物のゲノムを人為的に編集し、遺伝子欠損個体を作出する方法が発展していることから、ヨシノボリにもこれを適用する。ヨシノボリの脳は小さいため、脳への阻害剤投与は困難であることが予想されるので、神経回路素子を機能阻害する別の方法として、準備を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度は、二重in situ hygridizationに用いる組織学的解析用試薬の購入を計画していたが、この試薬を安価で自作できることが判明し、実際に作成した試薬が効率的に機能したため、組織学的解析用試薬の購入費用の大半を節約することができた。また、台湾の国立成功大学との共同研究の過程で、分子生物学的解析に必要な試薬類の一部を援助していただく事ができたため、このための費用も節約できた。また、行動生態学的解析の多くの部分を単独で行うことができたため、アルバイト人員は一人でまかなうことができ、謝金のための経費が少なくて済んだ。以上の理由から、当初の計画より助成金の使用額が少なくなり、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額となった費用と平成28年度予算を併せて、これまでの通り分子生物学・組織学的解析用試薬の購入に充てる他、ヨシノボリの脳および受精卵に試薬を投与するための系の確立を進めたい。また今年度は、神経トレーサーによる神経回路の可視化も進める必要があるため、この解析に必要な試薬および実験器材の購入に予算を充てる。
また、研究打ち合わせ、お見合い実験、研究発表のための旅費・学会参加費として予算を充てる他、今年度もアルバイト人員一人のための謝金を予定している。
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