| 研究課題/領域番号 |
15K18362
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山田 真弓 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50583457)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ニューロン新生 / 神経幹細胞 / 側脳室周囲 / RNAシークエンス / 神経発生 / 遺伝子発現プロファイル |
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| 研究実績の概要 |
中枢神経系において、神経細胞は胎生期から出生後しばらくの時期にのみ、神経幹細胞から生み出されると考えられてきた。しかし、最近の研究によって、ヒトを含めたほ乳類の成体脳においても、側脳室周囲の脳室下帯や海馬歯状回といった特定の領域では神経幹細胞が存在し、神経新生が継続的に続いていることが分かってきた。このような神経新生は、記憶・学習などの高次脳機能に関与することが明らかになってきている。本研究では、発生・発達に伴う神経幹細胞の性質の変化を明らかにするため、胎生期と成体期における遺伝子発現プロファイルの解析を行なった。さらに、神経新生に必要な遺伝子の探索を行なった。
神経幹細胞において蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて、FACSにより神経幹細胞を回収し、RNAシークエンスを行った。胎生期の終脳脳室帯と成体若齢期（2-3ヶ月齢）の側脳室周囲の遺伝子発現を比較して、2倍以上発現変動のある遺伝子のリストを作成した。さらに、既存のデータベースや文献と比較して、神経新生に関与し得る遺伝子のリストを作成した。同様に、成体老齢期（12ヶ月齢以上）の神経幹細胞についてもRNAシークエンスを行い、発生・発達に伴い、どのような遺伝子発現変動が生じているのかを調べた。
さらに、神経新生に関与し得る候補遺伝子の機能解析を行うために、レトロウイルスやレンチウイルスベクターの作製を行なった。ウイルスを培養神経幹細胞に感染させ、目的遺伝子の過剰発現を行い、神経新生への影響を観察できる実験系を確立した。さらに生体内での機能解析を行なうために、脳内にウイルスインジェクションする実験系のセットアップを行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題では、各ステージにおいてRNAシークエンスを行うために、マウスの準備が律速段階となる。胎生期の神経幹細胞を採取するためには数匹のトランスジェニックマウスがいれば十分であるが、成体期の解析には数十匹のトランスジェニックマウスが必要となる。さらに成体老齢期の解析を行なうためには、長い飼育期間が必要となる。実際に、準備していたよりも多くの成体老齢期のマウスが必要となり、研究計画の遂行が困難になったため、当初の計画を大幅に変更した。最近、報告が増えているシングルセルのRNAシークエンス方法を参考にし、数匹のマウスを用いて数百個の神経幹細胞からRNAシークエンスを行うことができた。この方法により、予定していた解析をすべて行うことができた。読み終えたRNAシークエンスについては、既存データベースや文献を参考にしながら解析を行った。さらに、神経新生に関与する候補遺伝子の機能解析を行うための実験系の準備も順調に行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで、胎児期から成体期のさまざまなステージにおいて、神経幹細胞の遺伝子発現プロファイルを作成することができた。さらに、各ステージにおける遺伝子発現を比較し、発現変動が大きい遺伝子の中から、特に成体脳において神経新生に関与する遺伝子候補を選択することができた。まだ、候補遺伝子の絞り込みが不十分であるため、今後はreal-time RT-PCRやin situ hybridizationなどにより、発現を確認し候補を絞る。さらに、培養神経幹細胞などを用いて、候補遺伝子の機能解析を行う。将来的には、ターゲット遺伝子のfloxマウスを作製し、神経幹細胞においてCreERT2を発現するNestin-CreERT2マウスやAscl1-CreERT2マウスとかけ合わせることによって、成体新生ニューロンにおけるコンディショナルノックアウトマウスを作製したい。そして、成体脳における、神経新生の意義についても解析を行いたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題では、さまざまなステージのマウス脳内から神経幹細胞を取り出し、その性質の変化を調べている、解析の途中で、使用するマウスのステージの変更やマウス準備に時間を要した。必要なデータはほとんど揃ったが、本研究課題の目的をより精緻に達成するためには、追加実験が必要である。さらに、これらの解析の成果を次年度の学会において発表したいと考えている。以上の理由により、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究推進に必要なデータは揃っているので、追加実験を行う。さらに、これまでの成果をまとめて学会で発表する。
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