| 研究課題/領域番号 |
15K18363
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
北澤 彩子 慶應義塾大学, 医学部, 講師(非常勤) (10535298)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 大脳新皮質錐体細胞 / 海馬CA1錐体細胞 / 細胞移動 / 異所的移植 / 子宮内胎児脳電気穿孔法 / Time-lapse imaging / 電子顕微鏡観察 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、マウス脳の大脳新皮質及び海馬CA1錐体細胞の移動様式の違いを移植および組織学的な観察により検討した。
細胞移動の違いが細胞ではなく環境の違いに依存しているかどうかを検討するため、異所的な移植を行った。大脳新皮質にEGFPプラスミドを、CA1錐体細胞にtd-Tomatoプラスミドを子宮内胎児電気穿孔法により導入した後、蛍光タンパク質により標識された細胞を同じ週齢のマウス脳の大脳新皮質あるいはCA1の脳室面付近に移植するための条件検討を行った。またTime-lapse imagingにおいても移植方法の最適化を試みた。それらの結果、同所で移植した場合、移植場所に留まる細胞と脳表面側に移動する細胞が多く見られ、異所に移植した場合、多くの細胞が脳室方向に移動する様子が観察された。これにより、異なる環境に置かれた細胞は、その場所に適応できないことが示唆された。今後、これらの所見の再現性を確認するとともに、両者の放射状グリア線維の性質の違いの検討と合わせて、CA1神経細胞自身の移動に用いられる分子機構などについても大脳新皮質の移動と比較検討することが必要である。
続いて、大脳新皮質とCA1錐体細胞の移動フィールドをそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡および電子顕微鏡により観察したところ、細胞体の密度や足場となる放射状グリア線維の分布に違いがある可能性が示唆された。また、以前の研究で報告した（Kitazawa et al., J. Neurosci. 2014）、大脳新皮質の神経細胞が移動する際の先導突起とは異なり、海馬CA1錐体細胞が移動する際の先導突起に多く見られる、varicosity部分を免疫電子顕微鏡観察により観察することも試みた結果、移動中の細胞を他の細胞から区別して観察することができた。以上の結果、大脳新皮質と海馬CA1の移動の違いが、単純に細胞密度の違いを含めた周囲の環境に依存するのではなく、細胞自身が持っている性質によるものである可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
移植実験においては、当初in uteroでの解析は移植場所の特定が困難であることや、移植された細胞が正常に移動しているかどうかを見極めることが困難であることが予想されたが、トレーサーを混ぜることで、移植場所の特定をすることが可能であることが明らかになった。また、Time-lapse imagingにおいては、脳室付近に移植を行う方法を様々試した結果、再現性のよい結果を得ることができ、大脳新皮質とCA1錐体細胞の移動が異なることを示すことができた。今後はその再現性を確認するために、移植細胞の定量を行う予定である。
また大脳新皮質およびCA1の移動領域を微細構造の面から観察するために電子顕微鏡試料を作製する際、幼弱な脳組織を鮮明に観察するため、包括型脳科学研究推進支援ネットワークリソース・技術支援からの指導およびアドバイスを受け、よりクリアな試料を作製することができた。今後さらに例数を重ねて観察する必要がある。また、技術面での向上も今後課題として残っている。以上の成果により、本年度はおおむね順調に進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
移植された細胞の移動方向や数については、同所・異所移植細胞を定量することで解析する。電子顕微鏡による検討につては、試料を増やし、varicosity部分の詳細な観察を引き続き行う。電子顕微鏡での立体画像取得については、通常の電子顕微鏡サンプル調整と少し異なるため、こちらも引き続きより鮮明に撮影できる試料作製の検討をする。そのほか、研究計画書で記載した通り研究を進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定だった3D電子顕微鏡の画像構築用機器については、電子顕微鏡用試料作製方法を現在検討中であるため、本年度は見送った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
3D電子顕微鏡試料を効率的に作製できる方法の検討と並行して、次年度以降に購入する予定である。
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