研究課題
ミオシンVI(Myo6)に変異をもつksvマウスのヘテロ接合体(ksv/+)は、早発・進行性の難聴を発症する。異なるマウス系統との交配実験から、その発症には、遺伝的背景効果が関与することが明らかとなった。本研究は、進行性難聴発症に機能するゲノム多型の同定を目的として以下の実験を実施した。・遺伝解析に基づいたMyo6-ksv/+マウスの難聴発症修飾遺伝子の同定昨年度の研究実施状況報告書に示したように、Myo6-ksv/+マウスが発症する進行性難聴の主要な要因は、Myo6-ksv/+の遺伝的背景であるC57BL/6J系統が有するカドヘリン23(Cdh23)の753番目のグアニンからアデニンへの置換(c.753G>A)であることが強く示唆されている。そこで、この修飾効果を実証するために本年度はC57BL/6J-Myo6-ksv/+マウスのCdh23の多型の編集(c.753A>G)により聴力表現型への効果を検証した。その結果、2ヵ月齢において、聴性脳幹刺激反応により測定した聴力は野生型と同程度に回復していた。また、Cdh23の多型を編集したマウスにおいては、Myo6-ksv/+マウスで観察される感覚毛融合が2ヵ月齢の両対立遺伝子マウスで確認できず、Cdh23の多型がMyo6-ksv/+ヘテロマウスの難聴発症を促進する効果を持つことが推定された。しかし、その効果は一過性であり、Cdh23の多型を編集したMyo6-ksv/+マウスは進行性難聴を発症し、生後8ヶ月後においては本研究で測定した4, 8, 16および32 kHzの周波数音における聴力は中~高度難聴のレベルに達していた。ksv変異によってMYO6タンパク質のモータードメインループ構造であるSwitch II領域の461番目のグルタミン酸はリジンへと置換(p.E461K)する。我々の行ったin Silico構造解析によってこの置換はMYO6モーター機能を大きく阻害することが示唆されたことから、Myo6-ksv/+マウスの早発・進行性難聴はp.E461K の極めて強い優性効果にCdh23多型の修飾効果が加わり重篤化するものと現時点では考えている。
3: やや遅れている
本研究の第一の主要目的であるB6-Myo6-ksv/+ヘテロマウスの早発・進行性難聴の発症メカニズムはほぼ解明できた。しかし、第二の主要目的であったヒト優性難聴発症の原因となる変異部位を模倣したMYO6-p.Cys442Tyrマウスの樹立、Myo6-ksv/+ヘテロマウスで同定した難聴発症修飾ゲノム多型の検証については28年度内に実施することができず、本研究は1年間研究期間を延長することとした。
29年度はMYO6-p.Cys442Tyrマウスをゲノム編集により作製し、作製したマウスの変異型対立遺伝子ホモおよびヘテロ個体の聴性脳幹刺激反応の測定および耳音響放射検査により聴力レベルを決定するとともに、走査型電子顕微鏡による有毛細胞の感覚毛形態観察を実施する。さらに樹立したマウスのCdh23の多型を野生型へと置換し、聴力検査、有毛細胞の形態観察などの表現型解析を行うことでMyo6-ksv/+ヘテロマウスで認められたCdh23多型の修飾効果を検証する。
本研究は、早発・進行性難聴を発症するB6-Myo6-ksv/+ヘテロマウスの病態発症メカニズムをほぼ明らかにできたできたが、ヒトにおいて優性の難聴発症原因となるヒトMYO6変異部位を模倣したMYO6-p.Cys442Tyrマウスの樹立に着手できなかったため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額は、MYO6-p.Cys442Tyrマウスの作製に使用するとともに、難聴発症修飾ゲノム多型の検証のための試薬等の消耗品購入に使用する。
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Human Molecular Genetics
巻: 25 ページ: 2045-2059
doi: https://doi.org/10.1093/hmg/ddw078
http://www.igakuken.or.jp/mammal/index.html