研究課題
エピジェネティック制御は、発生や疾病など、さまざまな生命現象に関わる重要な遺伝子発現制御機構で、近年大きな注目を集めている。ゲノムインプリンティングは、典型的なエピジェネティック制御機構で、哺乳類の発生や小児疾患の発症などにおいて、重要な役割を担っている。本研究課題では、ゲノムインプリンティング制御機構の包括的な解明を目指している。そのために、最新の方法論と、核移植によって作出された特殊な培養細胞を組み合せて、インプリンティング制御領域に、DNAメチル化状態に依存して結合するタンパク質、RNA、および相互作用する染色体領域の同定を行っている。平成２７年度には、Kagami-Ogata症候群やTemple症候群という小児疾患の原因領域となる、Dlk1-Dio3インプリンティング領域のIG-DMRを標的として解析を行った。 まず、メチル化IG-DMR結合因子候補、および非メチル化IG-DMR結合因子候補を複数単離した。次に、それらの中で、DNA結合因子や、クロマチン制御因子として知られていた６個の因子に着目し、IG-DMRへの結合能とDNAメチル化感受性を個別に検証した。その結果、２個の因子が新規のメチル化IG-DMR結合因子であることが判明した。さらに、このうちの１つを過剰発現させた細胞では、IG-DMRのメチル化が低下することを見いだした。今回見つかった２つの新規メチル化IG-DMR結合因子は、同一の分子経路で機能することが知られているものであった。そこで今後は、これらの因子がIG-DMRのメチル化制御にどのように関与しているのかを、細胞を使って解析していく。さらに、Prader-Willi症候群や、Beciwith-Wiedemann症候群の責任となるインプリンティング領域に着目し、それらに結合する因子の単離を行う予定である。
2: おおむね順調に進展している
培養細胞において、DNAのメチル化状態は、培養条件によって変動することが知られている。そこで、細胞をクローニングすることによって、継代をしてもインプリンティング領域のメチル化が正常に保たれる細胞系列（例えば、IG-DMRやH19-DMRは父親由来のアレルで高メチル化状態、母親由来のアレルで低メチル化状態となっている。逆に、Snrpn-DMRやKvDMRは、母親由来のアレルで高メチル化状態、父親由来のアレルで低メチル化状態となっている。）を樹立し、そのような細胞系列を実験に用いている。IG-DMRのメチル化感受性結合因子候補の中から、DNA結合因子や、クロマチン制御因子として知られていた６個を選定した。これらのcDNAを、タグペプチドを付加してクローニングし、レンチウィルスベクターによって細胞に導入した。タグペプチドを利用して免疫沈降を行い、IG-DMRへの結合能、およびDNAメチル化状態の違いによる結合能の変化を調べた。この解析から、２個の因子が、これまで知られていなかったメチル化IG-DMR結合タンパク質であることが分かった。また、このうちの１個を過剰発現させた細胞では、IG-DMRのメチル化が低下することも分かった。これら２個の因子は、同じ分子経路で機能していることが知られているため、現在は、２個の因子を同時に強制発現させた時の、IG-DMRのDNAメチル化への影響を解析している。タンパク質の同定は、質量分析によって行った。現在は、質量分析の感度の向上、培養条件の最適化を行っており、これによって、微量タンパク質をより高い定量性を持って同定することができると期待される。
平成２８年度は、新規メチル化IG-DMR結合因子の機能解析、およびインプリンティング領域結合因子の同定方法（スクリーニング系）の最適化、の２つを行う。新規メチル化IG-DMR結合因子の機能解析では、前年度に同定した２つの因子のIG-DMRへの結合能と、DNAメチル化感受性について、さらなる検証を行う。そのために、父親由来のアレルと母親由来のアレルを一塩基多型によって区別できる細胞を入手した。この細胞をクローニングして、継代をしてもIG-DMRを含め、複数のインプリンティング領域のメチル化が正常に保たれる（IG-DMRの場合は、父親由来のアレルが高メチル化、母親由来のアレルが低メチル化となっている）細胞系列を樹立する。この細胞にタグペプチドを付加したそれぞれの因子を、レンチウィルスベクターで導入し、タグペプチドを使ったクロマチン免疫沈降によって、因子が結合しているアレルを明らかにする。また、沈降してきたクロマチンのDNAメチル化状態を調べる。スクリーニング系の最適化では、タンパク質質量分析の感度と精度の向上を目指す。そのために、まずクロマチン免疫沈降で使っているタグペプチドを改良したり、分析に用いる細胞数を大幅に増やしたりする。また、質量分析をより高感度な機器を用いて行う。最適化した条件で、複数のインプリンティング領域を標的として、結合因子の同定を試みる。平成２８年度研究費の使途は、以上の研究を行うために、ES細胞の培養液代、クロマチン免疫沈降のための抗体などの試薬代、質量分析機の使用料が中心となる。
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