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DNA複製フォークの停止は、一本鎖DNAの露出やDNA二重鎖切断につながり、染色体不安定性の一因となる。チェックポイントキナーゼATR は細胞の生存に不可欠であり、これは自然な細胞増殖において、内因的な複製ストレスへの応答が重要であることを示唆する。しかし、通常の細胞増殖におけるATRの機能と活性化機構には不明な点が多い。本研究では下記のアプローチにより、種々の複製ストレス条件下におけるヒトATRおよびその関連因子の染色体結合制御を解析した。
1.複製ストレス高感受性部位へのATR活性化因子の結合動態解析:クロマチン免役沈降-定量PCR (ChIP-qPCR)法により、外的複製ストレス有無の条件下においてATR関連因子のクロマチン結合を調べた。その結果、ATRの活性化因子Rad9やTopBP1が、外的ストレスのない時にも染色体脆弱部位(Common Fragile Site)や初期複製開始領域に結合していた。これは、通常の細胞増殖時に、これらの領域において、内因的な複製ストレスが生じていることを示唆している。
2.人工的な複製フォーク停止誘導系の構築とそれによるDNA損傷応答機構の解析:染色体上にlacOリピートを保持するヒト培養細胞を用いて、LacIの結合したlacOリピートにおいて一本鎖DNAの露出とATR関連因子の集積が誘導されることを見いだした。CDC6およびATM経路やファンコニ経路因子の集積も認められた。平成28年度には、タモキシフェン誘導型のER-LacIの安定発現細胞を樹立し、損傷応答因子群の集積の時系列や依存性を明らかにした。また、細胞周期を同調した解析の結果、LacI結合が誘導するDNA損傷応答には、S期特異的な応答(複製フォークの衝突が原因と考えられる)と、複製には依存せずG1期にも誘導される応答(急激なクロマチン構造変換が原因と考えられる)の少なくとも2系統があることが示唆された。
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