研究課題
従来のX線よりも10億倍の強度と約1000分の1のパルス幅を持つX線自由電子レーザー(XFEL)の登場によって、これまで不可能であった無損傷の結晶構造解析や、非凍結結晶を用いた時分割構造解析が可能となった。これによって、酵素による高効率化学反応の可視化や、より高精度な薬剤の設計が期待されている。しかし、XFELを用いて得られたデータの解析方法はいまだ確立されていない。そこで、本研究では、巨大膜タンパク質であるウシ心筋由来チトクロム酸化酵素(CcO)を用いて、XFELによる常温下での高分解能データの収集および得られたデータの解析法の開発を行う。前年度に、JASRIの馬場・熊坂両博士の開発した「結晶調温湿システム」を用いることでCcO結晶を非凍結状態でビームライン上にて1時間以上安定に維持可能な条件の決定に成功した。この条件下で収集したデータから、2.2 Å分解能での立体構造解析に成功したが、本年度はさらに測定条件の検討を行い、より高分解能(2.0 Å分解能)でのデータ収集に成功した。この結果、より詳細な反応機構の議論が可能となるとともに、SACLAで収集したデータとの比較やデータ処理の際のリファレンスとしても利用することが可能な非凍結結晶データが得られた。本申請では、SPring-8を利用して凍結結晶から得られた高分解能データをリファレンスに利用して、SACLAを利用して非凍結結晶から得られたデータを精度高く処理することを目標としている。そのため、様々な酸化状態や基質複合体CcOの高分解能データをSPring-8を利用して収集する必要がある。今年度は休止酸化型、還元型の構造を1.5 Åと1.6 Åで決定することに成功し、さらに、基質であるcytochrome cとの複合体の結晶構造決定にも成功した。今後SACLAでのより精度の高い構造決定に貢献できることが期待される。
2: おおむね順調に進展している
タンパク質のX線結晶構造解析では、結晶を回転させながら回折データを収集して、各指数由来の回折強度を正確に計算し構造因子を求めている。しかし、XFELを用いた結晶構造解析ではフェムト秒レベルの短パルスX線を照射するので、タンパク質結晶を回転させながら回折データを収集することができず、従来の解析方法とは異なるXFEL用の新たなデータ解析方法の開発が必要とされる。近年、Uervirojnangkoornらの開発したプログラムPrime(eLife 2015;4:e05421)を利用してXFELを使って撮られたデータの解析を高精度で行うことが可能となっている。我々のグループはこのプログラムに対して、SPring-8で収集されたデータをリファレンスとして利用できるよう改良を加えた。現在、本プログラムを利用したデータ処理の結果について検討を行っている。同時に、真の無損傷構造解析のために、通常はCcOの1結晶につきXFELを複数回照射してデータ収集するところを、最初の1回照射して得られたデータのみを使用して構造決定を試みている。結晶につき1枚の回折像しか得られないので、当然必要な結晶の数が膨大になりデータ収集にもかなりの時間を要している。28年度までで約200個の結晶から解析に必要な最低限のデータ数を収集することに成功した。しかし、構造解析はデータ量が多ければ多いほど精度が高くなるので、29年度も引き続きデータの収集を行なっていきたい。さらに、SACLAで得られたデータの解析にも利用可能な高分解能データの収集を、SPring-8にて行い、基質であるcytochrome cとの複合体や、複数の酸化状態の構造を決定することに成功した。以上のことから、本来の計画から若干の修正はあったものの、当初の予定通りに研究は進行している。
研究計画は若干の修正があるものの順調に推移しているので、このまま計画通りSACLAでCcO結晶のデータ収集、解析を行う予定である。すでに収集した1結晶に複数回XFELを照射して得られたデータセットと、1結晶につきXFELを1照射のみ行ったデータセット(1結晶1照射データ)をそれぞれ改良したプログラムで処理してみて、得られた構造の精度を評価する。また、1結晶1照射データの収集は引き続き行い、より多くのデータを収集する。同時に、常温下でCcO結晶をさらに長時間安定に維持可能な条件の検討、及び分解能のさらなる向上を試みる。29年度は、これまで行われていなかった、SACLAでの非凍結結晶を用いた測定にも挑戦する。すでにSPring-8で開発した「結晶調温湿システム」を用いて非凍結条件でCcO結晶を長時間ある程度安定に維持可能であることは確認している。そこで、CcOの酸素還元反応メカニズムを明らかにするために、酸素アナログであるCOとCcOの複合体についてSACLAで非凍結結晶を用いた測定を行う予定である。
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Journal of Biological Chemistry
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