| 研究実績の概要 |
ニホンメダカ、ハブシメダカ交配による雑種第一代を用いたスクリーニングを行うため、オス側のニホンメダカには、ATF6の活性化をモニターするためのPBiP-EGFPおよびコントロールとしてユビキタスに発現するtagCFP-mito遺伝子が含まれている必要がある。掛け合わせにより、両遺伝子をホモザイガスに有する系統を樹立した。
また、スクリーニングのポジティブコントロールとしてATF6aのノックアウト系統を用いる予定である。当研究室において、以前TILLING法により取得されたATF6aナンセンス変異体に加えて、CRISPR/Cas9法により新たにATF6 exon2に変異が入ったノックアウト系統を樹立した。これらを、上述の系統に掛け合わせ、PBiP-EGFP, tagCFP-mito, ATF6a+/-の個体を得た。
次に、掛け合わせのメス側となるハブシメダカを入手・飼育・採卵して個体数を増やした。当初想定していたよりも採卵のペースが不規則であるため多くの掛け合わせが必要となる見込みであるため、メスハブシメダカを多く確保している。そして、ハブシメダカによるスクリーニングが実施できない事態に備え、異常頻発相同組換えを用いた別のスクリーニング系の立ち上げを開始した。具体的には、相同組換えを異常に頻発する変異体取得のため、CRISPR/Cas9による遺伝子破壊を試みた。これにより、候補となる2系統の樹立に成功した。
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