| 研究課題/領域番号 |
15K18536
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
梅津 大輝 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 研究員 (60620474)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | コンパートメント境界 / 細胞の選り分け / 細胞間認識 / トランスクリプトーム解析 |
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| 研究実績の概要 |
組織を区画化することは多細胞生物の発生に共通の原理である。発生過程において、一つの組織内においても細胞の自由な混ざり合いがある区画内に制限されることがある。このような区画はコンパートメントと呼ばれる。コンパートメント境界を維持するための細胞間のシグナル伝達、物理的特性、細胞動態などが次々と明らかにされてきている一方で、細胞の混ざり合いを防ぐ実行因子は同定されておらず、細胞間の接触面における局所的な相互作用を制御するメカニズムの理解までは至っていない。網羅的遺伝子発現解析、遺伝子工学、生物物理学などを組み合わせ、多角的にアプローチすることで、組織構築の統合的な理解をめざす。ショウジョウバエの翅は翅原基とよばれる上皮組織から生じる。 翅原基は発生を通じて前部(A)／後部(B)コンパートメントに分かれ、コンパートメント境界はまっすぐに維持される。本年度は、細胞によるコンパートメント境界の認識に関わる候補遺伝子の探索を試みた。トランスクリプトーム解析による網羅的解析に加え、機能的に関連が高いと見られる分子に的を絞って解析を行った。トランスクリプトーム解析においては、A及びP細胞間で発現に差異が見られる遺伝子の同定をめざした。発現量の違いが認められたものの中から、細胞間認識に関わりうるドメインを持つ23遺伝子を選定した。また、細胞間の認識に関わることが近年示唆されたToll遺伝子ファミリーからは、発現量の解析に基づいて4遺伝子を選定し、機能解析を進めた。その結果、Tollファミリーの4遺伝子の発現量の違いによって細胞が選り分けられることが明らかとなった。さらに、Toll-1のレポーター遺伝子の発現パターンはこの遺伝子がコンパートメント境界の維持に関わることを強く示唆していたことから、今後はToll遺伝子を中心に解析を進めることにしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
コンパートメント境界を維持する分子メカニズムを明らかにすることをめざし、トランスクリプトーム解析による網羅的解析に加え、機能的に関連が高いと見られる分子に的を絞って関連する遺伝子の探索を行った。トランスクリプトーム解析においては、A及びPコンパートメントに由来する細胞間で発現に差異が見られる遺伝子の同定をめざした。P細胞特異的に蛍光タンパク質Venusを発現するコンストラクトを用い、翅原基から蛍光フローサイトメトリーでVenus陽性と陰性の細胞を分取した。続いて、それぞれの細胞集団から全RNAを抽出しRNA-seqを行った。得られた膨大なデータから異種細胞間の認識に関わる候補分子を選定するため、バイオインフォマティクスによる解析を行った。A、P細胞間で発現量に大きな差異が認められたものの中から、細胞間の認識に関わることが知られる、LRR、Ig、FN III、カドヘリンリピートのドメインのいずれかを有する分子を網羅的に探索し、23遺伝子を選定した。また、細胞間の認識に関わることが近年示唆されたToll遺伝子群に注目し、翅原基において発現量が高かったToll-1、Toll-2、Toll-7、Toll-8の4遺伝子を候補として絞った。候補遺伝子を過剰発現する体細胞クローンをモザイク状に誘導し、クローンが円滑な形態を示すことを細胞の選り分けの指標にして解析を行った。その結果、Toll遺伝子群の4遺伝子が細胞の選り分けの表現型を示した。これらの遺伝子の発現レベルの違いによって細胞が選り分けられうることが示された。さらに、 レポーター遺伝子の解析から、Toll-1がコンパートメント境界を境とした興味深い発現パターンを示すことが明らかになった。Toll遺伝子群が細胞の選り分けや組織境界の維持に関わるという報告は前例がなく、新規の分子メカニズムの解明につながることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
Toll遺伝子ファミリーのうち翅原基で発現量が多かった遺伝子、Toll-1、Toll-2、Toll-7、Toll-8の4遺伝子は、いずれも発現量の違いによって細胞の選り分けを引き起こすことが明らかになった。今後は、これらの遺伝子がコンパートメント境界における細胞間の認識機構に関わるかどうかを解析し、境界維持の分子メカニズムを明らかにする。Toll-1のレポーター遺伝子の発現パターンはこの遺伝子がコンパートメント境界の維持に関わることを強く示唆するものであった。そこで、上記の4遺伝子について、CRISPRによるゲノム編集技術によってVenusノックイン系統を作製し、それぞれの遺伝子の発現パターンと細胞内局在を明らかにすることをめざす。また、これらの遺伝子を過剰発現、又はRNAiによって機能阻害し、コンパートメント境界の形態に異常が生じるかどうかを解析する。これら4遺伝子が重複した機能を持つことも考えられることから、それぞれ単独のRNAi等で表現型が見られない時には、複数遺伝子を同時にノックダウンするコンストラクトを作製し、表現型を解析する。さらに、Venusのノックイン系統の生組織を用いてライブイメージングを行い、これらの分子が細胞内でどのような局在パターンと動態を示すかを明らかにする。得られた結果から相互作用しうる分子を推察し、遺伝学を用いて相互依存性を解析することや、培養細胞に遺伝子を発現させて細胞間の接着性への影響を検証するなど力学的な視点から解析を行う。以上のような多角的なアプローチを組み合わせて、コンパートメント境界における細胞間の認識と細胞の選り分けに関わるToll遺伝子群の分子機能を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度では、当初想定していたものよりも多くの遺伝子組換え体の作製が必要となることから、費用確保の必要性が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
遺伝子組換えショウジョウバエの作製にかかるインジェクションサービス委託費用に利用する計画である。
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