研究課題
今年度は、SnRK2タンパク質の活性を制御するペプチドに結合する、相互作用因子の探索を行った。まずはじめにin silicoデータ解析を行い、候補タンパク質の絞り込みを行った。その結果、候補遺伝子を約30遺伝子に絞り込むことに成功した。その後、SALK instituteから候補遺伝子の遺伝子破壊植物体の種子を取り寄せ、single およびdouble knockout mutantsライブラリーを作製した。このライブラリーを用いて、ペプチド、およびSnRK2タンパク質が制御する下流マーカー遺伝子の発現変動を指標にすることで、ペプチド－SnRK2タンパク質に関与する相互作用因子のスクリーニングを行うこととした。マーカー遺伝子は、アブシジン酸（ABA）合成酵素や、乾燥およびABA処理誘導性遺伝子群の中から、代表となる3遺伝子に着目し、発現変動解析を行った。その結果、1つのdouble knockout mutantsでは、乾燥ストレス処理において、マーカー遺伝子の発現が顕著に低下していることを明らかにした。これは、このdouble mutantsの原因因子となる2遺伝子が、ペプチド－SnRK2シグナル伝達系に関与することを示唆する。この原因因子2遺伝子は、受容体キナーゼをコードする遺伝子であることから、ペプチドの受容体候補であることが考えられた。以上の研究結果は、ペプチド－受容体－SnRK2キナーゼコンプレックスを同定することに成功したことを示す。また、ペプチドのプロモーター領域とGUSタンパク質を融合させたコンストラクトを形質転換させた植物体を用いて、組織特異的に発現するペプチドの様態を解析することができた。その結果、ペプチドは根や葉の維管束柔組織で、主に発現していることが明らかになった。これはペプチドがストレス依存的に細胞外に放出され、根から地上部に移動しやすい組織で、発現制御されている可能性を示唆する結果である。
2: おおむね順調に進展している
（理由）本年度は、ペプチド－SnRK2タンパク質のシグナル伝達系をつなぐ、重要な相互作用因子を同定することができ、順調に解析を進めることができた。研究を進めていく中で、ペプチドと結合する相互作用因子の代表的なものは、受容体タンパク質が大部分を占めるのではないかということが考えられた。受容体タンパク質は、細胞外に突出したドメイン部分でペプチドと結合することが一般的なため、細胞内で発現させたタンパク質ドメインとの相互作用を検出する酵母Two Hybridスクリーニング法では、適切な相互作用因子を絞り込むことが難しいことが予想された。そこで、ペプチドの相互作用因子を同定するにあたり、まずはじめにin silicoデータ解析を行うことにした。最終的には、この候補遺伝子群の中で作製した2重遺伝子破壊変異体でポジティブな結果を得られたことを考えると、ペプチドの相互作用因子候補を絞り込むことに成功し、多重遺伝子破壊変異体のライブラリーを作製する手間と時間を大幅に短縮できたところが、今年度中に相互作用因子を同定することに成功した大きな要因であると考えている。さらに今年度は、ペプチドのプロモーター領域とGUSタンパク質を融合させたコンストラクトを形質転換させた植物体を作製し終わり、組織特異的に発現するペプチドの様態を解析することができた。その結果、ペプチドは根や葉の維管束柔組織で、主に発現していることが明らかになった。これはペプチドがストレス依存的に細胞外に放出され、根から地上部に移動しやすい組織で、発現制御されている可能性を示唆する結果である。
（今後の推進方策）相互作用因子の組織特異的発現に関して、現在準備しているトランスジェニック植物体を用いて解析する。植物がペプチド－SnRK2sタンパク質モジュールを使って、どの組織で浸透圧ストレスを感知し、細胞内に伝達しているのかを明らかにするのは、本研究課題において重要な実験である。茎や葉の維管束、維管束柔組織での発現を特に詳細に解析する。また、着目しているペプチドは、浸透圧ストレス依存的に細胞外に放出される。しかし、ペプチドの蓄積量はいまだ不明である。ペプチドの生理活性緑芽、タンパク質の量に依存するのか、活性力価に依存するのかを調べる必要がある。高感度質量分析計を用いて、ストレス依存的に細胞外に蓄積するペプチドを定量する。さらに多重遺伝子破壊変異体や、過剰発現体を作製し、乾燥ストレスに対する耐性を評価したり、乾燥ストレス条件下での気孔の開閉や、アブシジン酸（ABA）の蓄積量など、植物個体レベルでの生理応答の変化に関しても解析を進める予定である。
（理由）研究の推進度は概ね順調であるが、相互作用因子タンパク質の組織特異的発現を解析するためのGUSタンパク質染色や、アブシジン酸（ABA）測定キット、高感度質量分析計を使った目的ペプチドの定量解析などに関して、当初の予定よりやや遅れている。そのため、解析に必要となる染色基質タンパク質やホルモン解析用キット、分析・分離カラムの購入時期をずらしており、次年度使用額が生じることとなった。
（使用計画）次年度の計画において、相互作用因子タンパク質の植物組織レベルでの発現解析、ABA測定や、高感度質量分析計を使ったペプチドの定量実験を計画しており、次年度使用額をこれらの実験の遂行に必要な消耗品などの購入に使用する計画である。
すべて 2017
すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 謝辞記載あり 1件)
Plant Biotechnology Journal
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
10.1111/pbi.12731.
