| 研究課題/領域番号 |
15K18569
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
小林 勇喜 広島大学, 総合科学研究科, 助教 (80736421)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | メラノコルチン受容体 / Gタンパク質共役型受容体 / 脳下垂体ホルモン / 無脊椎動物 |
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| 研究実績の概要 |
脳下垂体は様々なホルモンを産生し、内分泌の要となる重要な器官である。しかし、脊索動物および無脊椎動物において、脊椎動物の腺性下垂体に対応するホルモンの同定はなされておらず、腺性下垂体のシステムは脊椎動物の進化の過程で獲得されたと推測されてきた。申請者は、興味深いことに腺性下垂体ホルモンの一種である黒色素胞刺激ホルモン（MSH）受容体と相同な遺伝子の存在を軟体動物である“カキ”および脊索動物である“カタユウレイボヤ”のゲノムデータベースから見出した。本研究では、当該受容体遺伝子を同定し、機能解析を行うことでMSHシステムの進化的背景および、無脊椎動物から脊椎動物を通した統括的な理解の基盤を確立し、これまで不明であった腺性下垂体の進化およびそのホルモン研究のブレイクスルーを目指した。まず、無脊椎動物のあらゆる組織から全RNAおよびゲノムDNAを安定して抽出可能な条件を確立した。また、最新のゲノムデータベースを参考にMSH様受容体特異的プライマーをデザインした。これらをツールとして、クローニングを試みた結果、カキから4種類、カタユウレイボヤからは2種類のMSH様受容体の断片を得た。加えて、カキでは内臓神経節で3種類が強く、残る１つは外套膜で顕著に発現していることを明らかにした。また幸運にも脊椎動物と無脊椎動物の間に位置するナメクジウオをサンプリングすることが出来た。ナメクジウオもゲノムデータベースが充実しており、既に候補遺伝子のクローニングに着手済みである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定していたMSH様受容体の全構造を明らかにする迄には至っていないが、ゲノムデータベースの更新により当初想定していたより多くの候補遺伝子の部分構造を明らかにした。さらに幸運にも、ゲノムデータベースが充実しており、モデル生物として注目されている脊椎動物と無脊椎動物の間に位置するナメクジウオを手に入れる機会があった。既に、ナメクジウオを用いてMSH様受容体のクローニングに着手している。
以上より、一部遅れている項目はあるが、当初の予定より得られた収穫も多くおおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
カキ、カタユウレイボヤに加えてナメクジウオからMSH様受容体のクローニングを引き続き行い、全構造を明らかにする。その後、発現ベクター系を構築し、培養細胞発現系を用いて真にMSH受容体であるかを精査する。具体的には、魚類型MSH類（N末端がアセチル化修飾された物とされていない物が存在するため、これら2種）を用いて、脊椎動物のMSH受容体のメインシグナルであるcAMP亢進能を解析する。この際、魚類型MSH類に対して応答を示さない場合には、脊椎動物MSHの最小活性単位であるHis-Phe-Arg-Trpの4連のペプチドを合成し、活性を測定する等、柔軟に対応する。また、受容体と培養細胞がヘテロガスな系であること、GPCRのGタンパク質共役能が進化の過程で変化することを考慮し、蛍光プレートリーダーを用いたリアルタイム細胞内Ca2+濃度変動アッセイ、リン酸化特異抗体を用いた細胞外シグナルキナーゼ（ERK） アッセイ（ウエスタンブロッティング）等も視野に入れる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究計画のヒントとなったゲノムデータベースの更新および想定していなかった貴重な生物の取得により、多少の計画変更を行ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
カキ、カタユウレイボヤに加えてナメクジウオからMSH様受容体のクローニングを引き続き行い、全構造を明らかにする。その後、発現ベクター系を構築し、培養細胞発現系を用いて真にMSH受容体であるかを精査する。具体的には、魚類型MSH類を用いて、脊椎動物のMSH受容体のメインシグナルであるcAMP亢進能を中心に解析する。以上を遂行するべく、分子生物学用、生化学用試薬、タンパク質合成、各種阻害剤等の購入に充てる。
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