| 研究課題/領域番号 |
15K18593
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| 研究機関 | 東京学芸大学 |
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研究代表者 |
西井 かなえ 東京学芸大学, 教育学部, 研究員 (50743770)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 遺伝子マップ / 次世代シーケンス / 茎頂分裂組織 / 国際情報交換 / イギリス |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、Streptocarpus属でRADseqを行うため予備実験、実験方法の検討を主に行った。
RADseqには、高純度及び高濃度のDNAが必要である。DNA抽出法の検討を行った結果、CTAB法が最も効率がよくDNA回収できた。また、CTAB法とフェノール抽出法を組み合わせて純度を高めることに成功した。
偏心ロゼットStreptocarpus rexiiと中心ロゼットStreptocarpus kentaniensisの交配第二世代を共同研究機関であるエジンバラ植物園で約50個体育成し、同植物園にてDNA抽出を行った。EcoRIとBglIIを利用したダブルダイジェストRADseqテストランを、龍谷大学にて共同研究として行った。両親サンプルであるS. rexii, S. kentaniensisと交配第二世代集団50サンプルよりそれぞれDNA抽出、ライブラリー作成、RADseqを行った。
RADseqデータ評価を、FastQCプログラムで行うと、DNA塩基GCの偏りが見られた。これは、DNAを葉から抽出したため、葉緑体DNAの割合が多いためであると考えられた。そこで、RADseqデータより葉緑体DNA配列を除き、再度解析を行った結果、GCの偏りが減少した。
得られたデータを用いて、STACKSプログラムによりRADseq解析を行い、遺伝子マーカーを探索した結果、750~1200の有効マーカーが得られた。各マーカーの平均リード数は36リードであった。これらの結果により、S. rexiiとS. kentaniensisの交配第二世代を用いた遺伝子マップ作製に、EcoRIとBglIIを用いたRADseqが非常に有効であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、中心ロゼット種Streptocarpus kentaniensisの形態解析を行い、茎頂分裂組織の形成過程を観察した。また、偏心ロゼット種Streptocarpus rexiiと中心ロゼット種S. kentaniensisの交配第一世代、交配第二世代の観察より、中心ロゼットが偏心ロゼットに対して優位に現れることを観察した。
茎頂分裂組織制御遺伝子単離に向け、遺伝子マップを作成するため、次世代シーケンサーを用いたRADseq解析を行うが、本年度はRADseq実施のため実験方法の検討を行った。
まず、RADseqに用いることのできる高濃度、高純度DNA抽出法を検討した。検討した方法によりDNA抽出を行うことができた。そこで、使用する制限酵素が適切であるか、またダブルダイジェストRADseqがStreptocarpus遺伝子マーカー開発に適しているか確認するため、小規模集団を用いてRADseqテストランを行った。リード数、マーカー数などを確認した結果、StreptocarpusにおいてRADseqが有効であることを確認できた。そこで、次年度は>200個体の大規模集団を育成し、形質の評価を行う。植物体の形質評価終了後、DNA抽出を行い、大規模RADseq解析の準備を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、Streptocarpus kentaniensisの形態形成を走査型電子顕微鏡と切片観察により詳細に解析し、Streptocarpus rexiiの形態形成過程との比較解析を行う。
遺伝子マップ作製とQTL解析に向け、予定通りに大規模集団を用いてRADseqを行う準備を次年度は行う。それに加えて、ゲノムシーケンスをエジンバラ植物園と共同でエジンバラ大学にて行うことが出来ることとなった。これは、本研究にとって大変有意義である。ゲノムシーケンスデータを得ることにより、ショートリードマーカーであるRADseq遺伝子マーカーの評価を行うことができる。以前の研究からも、RADseqデータのみでの解析と比較して、ゲノムシーケンスにRADseqデータをマップする方が、より精度が高く多数のマーカーが得られることが示されている。さらに、ゲノムシーケンスを得ることにより、マーカー配列から遺伝子情報が得られる確率が飛躍的に上がることが期待される。
また、S. kentaniensisとS. rexiiのRNAseqも、エジンバラ植物園と共同で行うことができるようになった。これにより、トランスクリプトームデータを得ることが出来る。RADseq、ゲノムシーケンス、トランスクリプトームデータを組み合わせて、茎頂分裂組織制御遺伝子の単離に向け、Streptocarpusにおける遺伝学的データ整備を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
RADseqのためのDNA抽出を、CTAB法で行ったため、キットを用いた場合と比較して予算を削減することが出来た。さらに、エジンバラ植物園との共同研究としてRADseqを施行したため、植物栽培費用、DNA抽出費用を削減することが出来た。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に行う大規模RADseqの費用の一部として使用する計画である。
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| 備考 |
Streptocarpus研究を、エジンバラ植物園のM. Moeller博士、エジンバラ大学のA. Hudson博士、BioSSのF. Wright博士、ミラノ大学のA. Spada博士、そして國立台湾大学のCN Wang博士と連携して行っている。
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