| 研究課題/領域番号 |
15K18667
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
水口 千穂 (鈴木千穂) 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教 (10733032)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | bacterial nucleoid / plasmid / Pseudomonas |
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| 研究実績の概要 |
本年度はPseudomonas putida KT2440株の染色体上に存在するNdpAホモログをコードする遺伝子 (PP_0973) とプラスミドpCAR1上の同ホモログ (Pnd) をコードする遺伝子の破壊株を作製し、表現型解析を試みた。pCAR1保持・非保持株のPP_0973破壊株については目立った表現型は見られなかったが、KT2440(pCAR1)株においてPP_0973とpndを同時に破壊しようとすると、pCAR1由来のカルバゾール資化能が欠落しやすいことが判明した。カルバゾール資化能に関与する遺伝子群は相同組換えによって欠失することが過去に報告されているため、現在、pCAR1上のどの領域で相同組換えが起きたのか詳細に調べると共に、上記の二重破壊株で相同組換えの頻度が上昇した可能性を検討している。
またChIP-Seq解析を行うため、PndとPP_0973産物それぞれについて抗体の作製を試みたが、両者のアミノ酸配列の相同性が86%と高いためか、特異的な抗体は得られなかった。現在、両者の間で保存性の低い領域を標的に、合成ペプチドを抗原として新たに抗体の作製を進めている。同時に、それでも特異的な抗体が得られなかった場合のことも考え、pndの遺伝子末端にヒスチジンタグ配列を挿入した株も作製した。良い抗体が得られなかった場合には、この株を用いてヒスチジンタグ抗体でChIP-Seq解析を進める予定である。同様の現象はHUホモログの解析を行う場合にも生じる可能性があるため、pCAR1上のHUホモログ (Phu) についても、phu遺伝子末端にヒスチジンタグ配列を挿入した株を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本実験では遺伝子破壊株、ヒスチジンタグ挿入株のいずれについても、耐性遺伝子マーカーを最終的に抜く方法を採用したため、各株の作製に予想以上に時間がかかってしまい、また抗体の作製も難航したことから、当初の計画よりやや遅れてしまった。しかしPP_0973とpndの二重破壊株について表現型の変化が見られたのは良い傾向であり、来年度はこの表現型を深く掘り下げることでNdpAホモログの機能に迫りたいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画がやや遅れているため研究体制を見直し、最終年度となる来年度は本研究テーマを遂行する大学院学生・学部学生を増やして対応する。本年度作製した株を用いて、引き続き表現型解析やChIP-Seq解析を進めると同時に、NdpAホモログのタンパク質としての機能解析にも着手する。最近報告された大腸菌のホモログ (YejK, Pseudomonas属細菌のNdpAホモログとは相同性が約30%) と同様のDNA結合能、細胞内局在性を持つのか、何量体で存在するのかなど基本的な性質を調べた上で、結晶構造解析にも挑戦したい。
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