研究課題
真核生物に広く保存されているTRP(Transient Receptor Potential)チャネルの原型である酵母TRPY1チャネルの脂質分子による活性調節機構の解明をめざす。酵母を高浸透圧に晒すと数秒以内に酵母液胞膜局在性TRPY1チャネルが活性化して液胞内から細胞質へCa2+が流入する。細胞質へのCa2+の流入にはPI(3,5)P2が必要であることを国外の研究グループが報告しているが、PI(3,5)P2が必須なのかPI(3)Pの蓄積によってCa2+流入が抑制されているのかは未解明である。PI(3)Pを脱リン酸化してPIを生合成するSac1の変異株ではPI(3)Pの蓄積が予想される。sac1変異株を用いてCa2+流入を観察したところCa2+の大幅な減少が見られた。本実験によってPI(3)Pの蓄積が高浸透圧ストレス応答性のCa2+流入を抑制することを見出した。酵母のCa2+輸送体研究を進めていくなかでCa2+の輸送活性が示唆される新規の輸送体候補を見出した。本輸送体のシロイヌナズナにおけるホモログタンパク質は高浸透圧応答性のCa2+輸送体であることが報告されている。酵母輸送体候補の遺伝子破壊株を小胞体ストレスを誘導するツニカマイシン含有培地で培養したところツニカマイシンに感受性を示した。酵母の幾つかのCa2+輸送体の変異株では、Ca2+輸送活性の欠損によってツニカマイシン感受性になることが報告されている。さらに、細胞壁合成阻害剤を含む培地で培養したところ細胞の形態異常と増殖抑制が見られたことから、本輸送体はCa2+輸送によって細胞壁合成を制御する役割をになっていることを明らかにした。
1: 当初の計画以上に進展している
目標としていたTRPY1を制御するホスファチジルイノシトール類の同定を達成することに成功した。また、新たに明らかになった分子メカニズムからTRPY1の高浸透圧応答に関わる可能性がある別のタンパク質分子の存在が推察された。このことから高浸透圧応答機構の全容の解明に前進することが可能となった。さらに、本研究を進めることで新規の酵母Ca2+輸送体候補を見出すことに成功し。Ca2+輸送体が酵母の生体活動の維持において多面的に関わっていることが明らかになった。
TRPY1の高浸透圧応答機構には細胞骨格が関わっていることが推察された。そのため、チューブリン脱重合剤やアクチン脱重合剤などを用いて細胞骨格の有無によって高浸透圧応答に変化が生じないか検討を行う。新規のCa2+輸送体候補遺伝子欠損株では細胞壁合成に異常をきたしている可能性があるため、細胞壁の成分を分析する。硫酸フェノール法を用いて細胞壁を単糖に分解し、生じた単糖の比率を求める。また、細胞壁を構成しているマンノプロテイン、グルカン、キチンを認識する抗体を使って免疫染色を行い、各構成成分の変化を野生型と比較する。新規輸送体候補の輸送基質は未同定なので電気生理学的手法やCa2+指示薬を用いて解析を行う。
次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成27年度請求額とあわせ、平成28年度の研究遂行に使用する予定である。また、新規Ca2+輸送体の変異株の表現型解析において予想外の実験結果が得られたため、平成27年度に予定していた遺伝子破壊株の作成を次年度に行うことになった。そのため、H27年度に購入予定していた遺伝子工学試薬の一部を次年度に購入することとした。
電気生理学実験によるチャネル活性の測定を予定しているため、ガラス器具、プラスチック器具、電子部品を消耗品として購入する。 電気生理学的実験に用いる巨大化酵母の調製などに必要な培地、酵素試薬、化学薬品などの消耗品を購入する。変異遺伝子の作成や酵 母細胞に形質導入したチャネル遺伝子の発現を確認するためリアルタイムPCRなどの遺伝子工学実験用の試薬を購入する。成果発表となる国際誌への論文投稿をめざし、英文校正代と論文投稿料を計上した。国内の学会と国際学会に積極的に参加し、本研究の成果を発表するために出張費を計上する。
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 2件、 査読あり 2件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件)
Nature Communications
巻: 6095 ページ: -
doi:10.1038/ncomms7095
Curr. Opin. Biotechnol.
巻: 32 ページ: 113-120
doi:10.1016/j.copbio.2014.11.025
