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本研究では、D-アミノ酸酸化還元酵素を利用したD-アミノ酸酵素分析法の開発を目的とし、好熱菌から安定性に優れたD-アミノ酸酸化還元酵素を見出す事を目標とした。温泉土壌から好熱菌を培養し、既存の酵素のアミノ酸配列やDNA塩基配列情報に頼らず、活性染色法による酵素活性の検出から新規酸化還元酵素を見出す計画であった。
平成29年度は秋田県小安峡温泉、宮城県鬼首温泉から温泉土壌を採取した。これらの温泉土壌をろ過して砂泥を除き、ろ液を2%寒天培地に塗布した後、55℃で培養を行った。本年度は、主な窒素源及び炭素源をD-アミノ酸に限定した寒天培地を用いることで、酸化還元酵素を含むD-アミノ酸代謝関連酵素を有する好熱菌の選択的な培養を試みた。栄養源としたD-アミノ酸には、ヒトでの重要な生理機能が明らかとなっているD-アスパラギン酸（D-Asp）とD-セリン（D-Ser）を使用した。3日間の培養後、D-Asp添加培地から558株、D-Ser添加培地から69株の好熱菌を得た。これらの株を、窒素源を各D-アミノ酸、炭素源をグルコースとした液体培地にて培養を行い、D-アミノ酸の減少を調べた。その結果、培地中のD-Asp濃度が5%以上減少した株が71株、D-Ser濃度が5%以上減少した株が13株見出された。続いて、培地中のD-アミノ酸減少率が高かった株から65株を対象として、活性染色法によるD-アミノ酸酸化還元酵素活性の検出を試みた。しかしながら、D-アミノ酸酸化還元酵素活性は検出されなかった。
本年度はD-アミノ酸を栄養源とした培地を用いることで、D-アミノ酸代謝関連酵素を有する可能性が高い好熱菌84株を得ることに成功した。今後、目的の酵素を見出すためには、寒天培地上のコロニーを対象とした活性染色等によるスクリーニングの効率化、及びより多くの温泉土壌のサンプリングが必要である。
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