| 研究課題/領域番号 |
15K18685
|
|---|
| 研究機関 | 秋田県立大学 |
|---|
研究代表者 |
鈴木 龍一郎 秋田県立大学, 生物資源科学部, 助教 (70632397)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | 構造生物学 / 酵素学 / 農芸化学 |
|---|
| 研究実績の概要 |
シアノバクテリア Cyanothece sp. ATCC 51142 株は、アミロペクチン様の不溶性分岐多糖を蓄積し、3種類の枝作り酵素（BE）アイソザイム（cceBE1、cceBE2、cceBE3）を有している。これまでに、大腸菌、結核菌、イネ、ヒト由来BEの結晶構造が報告されているが、活性中心で糖鎖と複合体を形成した状態の構造は報告されていなかった。昨年度に、cceBE1 の結晶に糖鎖をソーキングした状態での結晶構造解析を行った。その結果、cceBE1 の活性部位クレフト（サブサイト）に糖鎖が結合した状態の結晶構造の解明に成功し、サブサイト-7に位置する Trp610 が転移する分岐鎖の長さの制御に関わることを見出した。さらに、酵素表面の糖鎖結合部位（SBS）を7カ所同定した。触媒ドメインに位置している2カ所（A1とA2）について、糖鎖との結合に重要なアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体解析を行い、cceBE1 の酵素反応に直接的に関わることを裏付けた。以上の成果から、BE の作用機序を世界で初めて提案した。
本年度は、cceBE1のサブサイト-6～-2に位置するアミノ酸残基の変異体解析を行った。これら変異体の特性は野生型cceBE1と比べて変化しなかったことから、サブサイト-7～-1のうち、-7のみが特性の制御に関わることを確認した。また、A1とA2を形成するアミノ酸残基の変異体の結晶構造を解析したところ、A1 変異体については高次構造に変化が無いことを確認したが、A2 変異体については変異を導入した残基に隣接しているαへリックスが崩れていることを見出した。さらに5カ所のSBS（48_1、48_2、C1、C2、C3）について、糖鎖との結合に重要なアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体解析を行い、これらSBSがcceBE1の酵素活性に関わることを明らかにした。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
枝作り酵素（BE）は、貯蔵α-グルカン（グリコーゲンおよび澱粉）の分岐鎖形成を担う鍵酵素である。これまで、BE の活性部位クレフト（サブサイト）は同定されておらず、糖鎖結合様式は未解明であった。本研究ではシアノバクテリア Cyanothece sp. ATCC 51142 株由来 cceBE1 に着目して結晶構造解析を行い、サブサイト -7～-1 および酵素表面の糖鎖結合部位（SBS）7 カ所を見出した。変異体解析によって、サブサイトおよび SBS を形成する重要なアミノ酸残基の重要性を検証し、これらアミノ酸残基が基質糖鎖と相互作用していることを確認した。また、7 カ所の SBS のうち、触媒ドメインに位置している A1 および A2 を形成しているアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体については結晶構造解析も行い、これらの残基が糖鎖との結合に必須であることを裏付けた。cceBE1 は主にグルコース重合度（DP）6 から成る分岐鎖を DP10 のグルカン鎖に転移するが、供与体基質および受容体基質はそれぞれサブサイトおよび A2 によって制御されていることを明らかにした。これらの知見を昨年度提唱した cceBE1 の反応機構モデルに反映し、より信頼性の高い改訂モデルを考案できた。
cceBE1 の反応機構モデル提唱の成果は、Journal of Biological Chemistry 誌に発表した。また、cceBE1 の SBS に糖鎖が結合した状態で決定した結晶構造および変異体解析の成果は、学術誌に発表する予定である。以上のことから、順調に成果が得られていると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
シアノバクテリア Cyanothece sp. ATCC 51142 株は、3 種類の枝作り酵素（BE）アイソザイム（cceBE1、cceBE2、cceBE3）を有している。現時点で提唱している BE の反応機構モデルを検証し、より正確なモデルを提案するために、cceBE1 を用いて以下の研究を推進する。I. cceBE1 のサブサイト -7 の壁が転移する分岐鎖長の制御に関わるかどうか検証するため、壁を形成しているアミノ酸残基を欠損した変異体の解析を行う。II. 現在考えている cceBE1 の供与体基質および受容体基質の結合部位を検証するため、酵素表面の基質糖鎖結合部位 2 カ所（触媒ドメインに位置しているA1とA2）とサブサイト -1 の間に位置しているアミノ酸残基の変異体解析を行う。
これまでの研究から cceBE3 のアミノ酸配列と酵素特性は、cceBE1 および cceBE2 とは著しく異なることを見出している。また、Cyanobacterium sp. NBRC 102756 株についても、ATCC 51142 株由来 BE アイソザイム 3 種と同様の特性を有する 3 種類の BE アイソザイム（NBRC_BE1、NBRC_BE2、NBRC_BE3）を有することを明らかにしている。特性の異なる BE 間においても、作用機序は同一であるか検証する必要がある。そこで、cceBE3 または NBRC_BE3 の構造機能相関を解明することを目的として、結晶構造解析を試みる。
|
