| 研究課題/領域番号 |
15K18805
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| 研究機関 | 地方独立行政法人北海道立総合研究機構 |
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研究代表者 |
藤井 貴志 地方独立行政法人北海道立総合研究機構, その他部局等, 研究員 (60609105)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ウシ / 体外受精胚 / アクアポリン / 凍結保存 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、水およびグリセリン等の凍害防止剤の両方を透過させる機能を持つアクアポリン（AQP）3、AQP7、AQP9およびAQP10のウシ初期胚における発現を明らかにするため、RT-PCR法およびリアルタイムRT-PCR法によるmRNA発現解析と蛍光免液染色によるタンパク質の局在解析を実施した。AQP3およびAQP7 mRNAは、体外成熟卵子、体外受精由来の2-4細胞期胚、8-16細胞期胚、後期桑実期胚、初期胚盤胞期胚、胚盤胞期胚および拡張胚盤胞期胚の全てのステージの胚で発現しており、それらの発現量は、8-16細胞期から後期桑実期および初期胚盤胞期への発生にともない有意に増加し、胚盤胞期および拡張胚盤胞期において有意に減少した。AQP9 mRNAは、卵子から初期胚盤胞期において発現していたが、胚盤胞期以降に発現が消失し、その発現量は、8-16細胞期で最も高く、後期桑実期への発生にともない減少した。一方、AQP10 mRNAは全てのステージで検出できなかった。蛍光免疫染色法によりAQP3タンパク質が胚盤胞期胚の細胞膜上に検出された。また、体外受精由来の胚盤胞期胚におけるAQP3mRNA発現量は、体内受精由来胚と比較して有意に低かった。次に、ウシ初期胚におけるAQP3発現と耐凍性との関係を調べるため、RNA干渉法によるAQP3発現抑制胚の作出を試みた。媒精6時間後の1細胞期胚の細胞質内にAQP3発現抑制用のsiRNAを注入し、体外発生培養7日目の胚盤胞期胚におけるAQP3mRNAの発現量を解析したが、AQP3siRNA注入区におけるAQP3mRNA発現の低下は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画通り、ウシ体外受精胚におけるAQPsのmRNA発現動態および体外受精胚と体内受精胚におけるAQP3発現量の違いを解析し、一定の成果を得た。しかし、RNA干渉法によるAQP発現抑制胚は作出出来ておらず、今後も発現抑制用のsiRNAの種類や注入量など条件検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、RNA干渉法によるAQP発現抑制胚の作出について検討する。AQP発現抑制胚の凍結またはガラス化保存後の生存性を解析することで、ウシ胚の耐凍性と関連するAQPを明らかにする。また、発生培地の浸透圧、マグネシウム濃度等がウシ体外受精胚のAQP発現に及ぼす影響を解析し、ウシ体外受精胚におけるAQP発現制御機構を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
人件費・謝金およびその他として計上していた100,000円は、英文校閲費および論文投稿料に使用する予定であったが、論文投稿が次年度以降となったため繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
英文校閲費および論文投稿料に使用する。
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