2016 年度実施状況報告書

花粉症治療を目的とした、デコイ核酸医薬の表面修飾ナノ粒子含有経鼻投与製剤の設計

研究課題

研究課題/領域番号	15K18848
研究機関	愛知学院大学
研究代表者	小川法子愛知学院大学, 薬学部, 講師 (80409359)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2019-03-31
キーワード	花粉症治療 / 経鼻投与製剤 / 核酸医薬
研究実績の概要	花粉症は、くしゃみ、鼻水、鼻閉などを主症状とするⅠ型アレルギー疾患であり、一度発症すると長く付き合ってかなければならない疾患である。近年、小児の３割以上にアレルギー性鼻炎の症状があることが報告されていることからも、副作用のない患者に優しい治療薬が求められている。デコイ核酸医薬は、炎症に関連した遺伝子群を効率よく制御することが可能であり、副作用が既存の薬物と比べて少ない。そこで本研究では、花粉症治療を目的としたデコイ核酸医薬の鼻局所投与製剤を企画した。デコイ核酸医薬は、酸や熱、ヌクレアーゼによる分解が懸念され、また速やかな代謝・排泄、細胞内導入率の低さから、単独で投与しても治療効果を得ることが困難であるという課題がある。そこで本研究では、酵素分解などから保護した状態で患部に送達することを目的として、デコイ核酸医薬の乳酸・グリコール酸共重合体ナノ粒子を作製した。調製したナノ粒子の評価として、本年度は主に、アレルギー性鼻炎モデル動物の作成と作成したモデル動物への治療効果の評価を試みた。免疫応答性の良いことで知られているBrown Norway系ラットに抗原とアジュバントの投与を行い、アレルギー性鼻炎モデル動物の作成を行った。感作の確認は、ELISA法でIgE抗体量を測定することで行った。IgE抗体量測定の結果、個体差はあるものの、Brown Norway系ラットでは昨年度に実施したWistar系ラットよりもIgE値が上昇した。感作した動物の中で高いIgE値を検出した個体について、鼻腔還流法による評価を試みた。鼻腔還流法は、抗原溶液を鼻腔に還流させることで鼻粘膜を刺激し、鼻血管からの赤血球の漏出を色素定量により評価する方法である。実験の結果、デコイ核酸医薬投与群では未投与と比較して色素漏出が減少した傾向を示したが、例数が十分でないため、今後、実験を重ねる予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由本年度は、デコイ核酸医薬の乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA) ナノ粒子の治療効果の評価を目的として、アレルギー性鼻炎モデル動物の作成と作成したモデル動物への治療効果の評価を試みた。昨年度の実験では、Wistar系ラットに対してアレルギー感作を行ったが、IgE抗体量の上昇が十分ではなかった。そこで本年度は、免疫応答性の良いことで知られているBrown Norway系ラットに対して、抗原とアジュバントの投与を行い、アレルギー性鼻炎モデル動物の作成を行った。感作の確認は、ELISA法によるIgE抗体量の測定で行った。測定の結果、個体差はあるものの、Brown Norway系ラットでは、昨年度に実施したWistar系ラットでの結果と比較してIgE値が上昇した。また、抗原の投与回数や投与後の飼育期間について、IgE値が高くなる感作条件を検討し、感作した動物の中で高いIgE値を検出した個体について、鼻腔還流法による評価を試みた。鼻腔還流法は、抗原溶液を鼻腔に還流させることで鼻粘膜を刺激し、鼻血管からの赤血球の漏出を色素定量により評価する方法である。投与製剤を両鼻腔に投与し、一定期間経過後に外科的処置を行い、鼻腔還流法による評価を行った。デコイ核酸医薬含有ナノ粒子を生理食塩液に分散し、投与製剤とした。実験の結果、デコイ核酸医薬投与群では対照と比較して色素漏出が減少の傾向を示したが、色素の静脈からの投与が困難であり、例数が十分でないため、今後、感作動物の作成も含めて実験を重ねる予定である。鼻腔還流法による評価後に安楽死させたラットについては、鼻中隔を採取しており、現在、鼻中隔粘膜中の青色色素量の定量を検討している。ラットの鼻中隔の粘膜が微量であるため、定量法の確立が課題である。アレルギー性鼻炎モデル動物の作成には成功したが、評価系に課題があり、研究は予定よりもやや遅れていると考える。
今後の研究の推進方策	今年度に引き続き、Brown Norway系ラットに抗原とアジュバントの投与を行い、アレルギー性鼻炎モデル動物の作成を行う。感作の確認は、ELISA法でIgE抗体量を測定することで行う。作成したアレルギー性鼻炎モデル動物に対して、デコイ核酸医薬含有ナノ粒子の抗炎症効果を評価する。引き続き、鼻腔還流法による評価を行うとともに、鼻腔還流法評価後に安楽死させたラットから採取した鼻中隔粘膜中の青色色素量の定量を検討する。青色色素量の定量においては、ラットの鼻中隔の粘膜が微量であるため、定量法の確立を行う。また、より詳細な抗炎症効果を評価するため、鼻腔還流法による血管透過性亢進評価と色素定量に加え、免疫染色や共焦点レーザー顕微鏡等によるに鼻粘膜組織評価ならびに分泌液中の免疫細胞の定量を試みる。デコイ核酸医薬含有ナノ粒子の投与によって、十分な抗炎症効果が得られない場合は、ナノ粒子の処方検討を行うとともに、温度感受性高分子等で成る投与用基剤をナノ粒子の分散液投与後に投与することで、製剤の粘膜付着を図ることを検討する。また、製剤投与－抗炎症評価の期間の違いによるデコイ核酸医薬の抗炎症作用の違いについても評価する。モデル動物での評価結果に伴い、ナノ粒子および投与製剤の処方設計を適宜行う予定である。また、上記のアレルギー性鼻炎モデル動物に対する治療効果の評価ならびにマクロファージ様細胞に対する評価ともに、デコイ核酸医薬含有ナノ粒子の対照として、デコイ核酸医薬非含有ナノ粒子についても評価を行い、デコイ核酸医薬の治療効果を確認する。
次年度使用額が生じた理由	アレルギーモデル動物を作成するにあたり、飼育期間が予定より長くなったことから、実験動物購入数が予定よりも少なくなったこと、またそれに付随して感作に使用する試薬類の購入を延期したため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額の使用計画	ナノ粒子の調製、粒子表面を修飾する各種高分子、粒子のマーカー、薬物などを購入する。また調製したナノ粒子の細胞への侵入性、取り込み、滞留性の評価実験などを行うため、細胞を維持・培養するための消耗品も購入する。さらに、動物実験を実施するため、実験用動物ならびに動物実験に用いる消耗品を購入する。さらに、本研究で得られた成果を学会で発表する目的で出張経費を、また投稿論文として発表するために論文の別刷などの諸経費を計上している。