| 研究課題/領域番号 |
15K18861
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
田中 亜紀 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (50432109)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 基本転写因子 / TFIIE / RNAポリメラーゼ clamp |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではクロマチン構造変換複合体であるSWI/SNF複合体が基本転写因子TFIIEを介してRNAポリメラーゼII(Pol II)の転写開始複合体を制御して、転写を活性化しているのかを解明することを目指す。本年度の研究計画である「ヒトTFIIEα ウイングドヘリックス(WH)領域の変異体とPol IIのclampとの結合実験により相互作用領域を同定する」に関しては、GSTタグ融合ヒト組換え体clampを作成してGST pull-downアッセイを行った。その結果TFIIEだけでなく、TFIIBおよびDSIFが結合した。Pol IIのclampはその活性を発揮するために構造変化が大きい領域であり、転写を開始するときにはPol IIがDNAを挟み込みやすくするためにclampにTFIIEが結合し、転写伸長のときにはclampに転写伸長因子DSIFが結合してPol IIがDNAを安定に挟むことを助けていると考えられている。今回の実験では新たに転写開始位置の決定や伸長への移行に関わるTFIIBもclampに強く結合することが分かった。またclampに対してTFIIEとTFIIBは協調的に結合する一方で、TFIIEとDSIFは競合的に結合した。これまでの我々の研究でTFIIEとTFIIBは協調的に転写開始から伸長への移行段階を制御していることを報告しており、今回の結果を含めるとPol IIのclampを介した機能である可能性が示唆された。一方「TFIIHによるTFIIEαのリン酸化およびin vitro転写アッセイにより転写活性を評価する」に関しては、TFIIEの欠失変異体を用いたin vitroリン酸化アッセイによりTFIIEのリン酸化領域を同定した。今後はこのリン酸化修飾がPol IIのclampにおけるTFIIEとDSIFの入れ替わりに関わるのかを解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究ではヒトTFIIEα ウイングドヘリックス(WH)領域が、（１）PICで転写を活性化させる分子機構、（２）SWI/SNF複合体との相互作用を介して転写を活性化させる分子機構の二方面から解析を進める計画である。（１）に関しては、TFIIEとTFIIBが協調的に、Pol IIのclampを介して転写開始から伸長への移行の制御に関わる可能性を示す結果が得られており、おおむね順調に進展している。さらにTFIIEとDSIFのclampにおける入れ替わりを、それらの因子のリン酸化等の翻訳後修飾による制御を含めて解析を進める準備が整いつつある。一方（２）に関しては、SWI/SNF複合体とTFIIEαの結合が見られており、TFIIEα WH領域がSWI/SNF複合体との相互作用に関わる可能性を示せている。本年度は、SWI/SNF複合体のサブユニットに対するsiRNA法によるノックダウンした細胞抽出液を用いて、TFIIEとの相互作用に関わるサブユニットを同定する計画であったが、SWI/SNF複合体のどのサブユニットが関わるのかを示すことができていない。さらに実験条件の検討を進めるが、TFIIEが結合するSWI/SNF複合体のサブユニットを同定できない場合は、TFIIEα側の相互作用に関わるアミノ酸を同定して、そのアミノ酸の変異体を用いて転写活性の評価を進めることとする。
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| 今後の研究の推進方策 |
TFIIEを介したPol IIの活性制御機構の解析に関しては、Pol IIのclampに対してTFIIEとTFIIBは協調的に結合する一方で、TFIIEとDSIFは競合的に結合することが示された。ClampにおけるTFIIEとDSIFの入れ替わりにTFIIBが与える影響を調べる。またこれらの因子が鋳型DNA上での転写活性に与える影響を調べるために、immobilized templateアッセイによりタンパク間相互作用や転写活性の評価を行う。さらに転写過程においてTFIIH, メディエーター複合体, pTEFbのキナーゼ活性が重要であることが知られている。また我々が行った実験においてもTFIIEはTFIIHによりリン酸化されることから、このリン酸化修飾が、Pol IIのclampにおけるTFIIEとDSIFの入れ替わりに影響を与えるのか、TFIIE以外の因子のリン酸化修飾の影響を含めて検討する。一方、TFIIEとSWI/SNF複合体による転写活性化機構の解析に関しては、TFIIEの変異体を用いてSWI/SNF複合体との相互作用領域を同定し、in vitro転写アッセイによる転写活性の評価を行う。またクロマチン免疫沈降法によりTFIIEとSWI/SNF複合体のDNA上での局在を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究ではヒトTFIIEα ウイングドヘリックス(WH)領域が、（１）PICで転写を活性化させる分子機構、（２）SWI/SNF複合体との相互作用を介して転写を活性化させる分子機構の二方面から解析を進める計画であるが、（２）に関して当初の計画通りに解析が進まず、解析に必要な試薬類等の出費が抑えられたためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度では、本年度に達成できなかったSWI/SNF複合体のサブユニットに対するsiRNA法によるノックダウンした細胞抽出液を用いたTFIIEとの相互作用サブユニットの同定を、再度条件検討を行うとともに、TFIIEα側の相互作用に関わるアミノ酸を同定して、そのアミノ酸の変異体を用いて転写活性の評価を進めることとする。これにより計画当初の目的の達成を目指す。
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