| 研究課題/領域番号 |
15K18862
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
中澤 志織 名古屋大学, 理学研究科, 特任助教 (40748414)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ホヤ / 受精 / 生化学 / プロテオミクス / 精子 |
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| 研究実績の概要 |
卵細胞を覆うタンパク質性の膜(卵外被) は、卵を多精や異種精子との融合から守ると同時に、受精相手となるべき精子にとっても強固な障壁となる。精子は単なる遺伝情報の一時保管容器ではなく、障壁を突破する各種機構を備えた特殊な細胞であり、受精を理解するには精子に備わったマシナリーを解明することが必要である。
前年度に、カタユウレイボヤにおいて、精子表面タンパク質濃縮画分に特定のメタロプロテアーゼ群が豊富に存在すること、広域メタロプロテアーゼ阻害薬が受精において、精子が卵外被突破するまでのいずれかの段階を阻害することを明らかにしてきた。一方で、精子が卵外被に通過孔を形成するとマボヤにおいては目されているユビキチン-プロテアソーム系(UPS)が、カタユウレイボヤの受精においてはマボヤほどの重要性を持たない可能性も浮上したため、当該年度においては、UPSに代わる卵外被穿孔形成因子の新規候補として、精子表面メタロプロテアーゼ群に着目し追及した。
これらのメタロプロテアーゼ群の発現・局在・受精における機能を免疫学的な方向からも解明する目的で、抗体を作製したが、不運にも全てが免疫染色では機能せず、資金面からこのアプローチを断念せざるを得なかった。これらのメタロプロテアーゼ群を8種類のTALENペアによるゲノム編集でノックアウトしたところ、卵細胞にいずれのTALENペアを注入した場合でも、初期発生は正常そうで高いノックアウト効率が見られた反面、尾退縮期に形態の異状が見られ始め、変態を完了することなくノックアウト個体が死滅してしまった。これらメタロプロテアーゼ群のmRNA発現が変態期に見られ、広域メタロプロテアーゼ阻害薬も発生期に同様の異状を引き起こしたことから、これらの遺伝子の機能は受精にはとどまらず、後期発生にも必須であるらしいことを発見した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究室で所有する装置を利用してLC/MSによるプロテオーム解析を高頻度に行う計画だったが、分析装置の故障で長期間にわたり運転ができなくなったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
卵外被突破機構の解明については、引き続き精子表面タンパク質濃縮画分に豊富なメタロプロテアーゼ群に重点を置いて推進する。残された期間と資金を鑑み、免疫学的/遺伝学的アプローチから生化学的/酵素学的アプローチに切り替え、活性や基質の方面からこれらメタロプロテアーゼ群の卵-精子相互作用における機能の詳細に迫る。
自己非自己認識因子候補分子s-Themisの検出と機能解明への取り組みについては、研究室員の調査によりs-Themisの定常領域にも膨大な多形が存在することが判明したことから、検出対象の正確な配列情報の必要性が高い従来の実験計画を変更し、多形をカバーできる方法を採る方が合理的であるとの判断に至った。s-Themisのサブクローニングを行い、本研究により精巣に高発現することが判明したUrabinタンパク質の遺伝子のプロモーターを探索し、s-Themisの優性阻害実験を行う。
また、ホヤ精子頭部において以前発見した新規細胞内構造物(2015年報告)が、ホヤにとどまらず予想以上に広い範囲の動物に存在することを発見したため、その成分・特徴・存在意義についても解明を進めている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究期間延長申請に記載した通り、研究遂行の上で頻回使用する必要があった機器が故障し使用できず、計画遂行に遅延が生じたため、試薬・器具の購入、学会発表および論文発表のための費用の使用が当初の予定より遅くなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究期間を延長し、機器分析を必要とする計画の一部を別のアプローチに変更、避けられない分析は他機関に依頼し、次年度計画の通り遂行する計画である。
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