| 研究課題/領域番号 |
15K19010
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
廣田 有子 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (50588259)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | リソソーム / トランスゴルジネットワーク / 膜タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
申請者が行ったこれまでの実験から、LAPTM4αはTGNからリソソームへと輸送されることが明らかとなっている。この輸送が如何にして行われているか、その分子メカニズムを明らかにすることを本年度の研究の目的とした。
小胞体で合成されたリソソーム膜タンパク質はゴルジ体を経てTGNで選別され、エンドソーム/リソソームへと輸送される。TGNからの輸送には、アダプタータンパク質(AP)複合体やGGA (Golgi-localizing, gamma-adaptin ear homology domain, ARF-binding protein)の関与が考えられる。そこで、LAPTM4αの輸送について、TGNからリソソームへの輸送に最も関与すると考えられるAP-1とGGA3に注目して、ヒトHeLa細胞を用いて以下の実験を行った。
タグ付きLAPTM4αを用いた免疫沈降（in vivo）解析でAP-1とGGA3との相互作用について検討をおこなったが、相互作用は認められなかった。各輸送タンパク質をRNAiで抑制しLAPTM4αのリソソームへの輸送の可否を明らかにしたが、AP-1やGGA3との関与が否定され、新たにLAPTM4αと相互作用しTGNからの輸送に関与し得る因子を同定することに成功した。また、LAPTM4αのユビキチン化がリソソームへの輸送に関与するか、ユビキチン化不能変異体を用いて検討をおこなったところ、ユビキチン化不能変異体においても依然ユビキチン化が観察され、さらにリソソームへの輸送とユビキチン化は必ずしも相関しないことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通りに、実験は遂行できているため。一部、当初の予想に反した結果が得られたが、計画通りに進まなかった場合に想定していた計画に則って遂行できたため、支障なく研究計画を進めることが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、新たに得られたLAPTM4αの相互作用タンパク質について、今後もそのタンパク質との機能解析を詳細に実施する。
また、LAPTM4αの生理機能の解析を目的として、LAPTM4αが実際に薬物輸送タンパク質として機能しているか否か、細胞レベルで以下のように検討する。①多くの抗がん剤 (daunorubicin, doxorubicin等) は蛍光物質であることを利用し、LAPTM4α野生型やPYモチーフ変異体、ユビキチン化不能変異体を発現した細胞あるいは正常およびLAPTM4α欠損マウス胎児繊維芽細胞を用いてこれら薬物の細胞内分布を共焦点レーザー顕微鏡により調べる。②細胞膜に局在するLAPTM4αが抗がん剤の細胞外への排出に寄与するか否か、daunorubicin等の細胞内への取り込みをフローサイトメトリーによって定量する。③アデノウイルスベクターによるLAPTM4αの過剰発現系を構築し、LAPTM4α欠損マウスの胎児繊維芽細胞で観察される薬物感受性がLAPTM4αの過剰発現により回復または耐性を獲得するか否かについて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度使用予定であった、細胞培養に係る経費（血清や培地、抗生物質等）が一部、計画変更のため使用しなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画の一部変更に伴い、次年度のタンパク質ータンパク質相互作用の詳細解析を目的とした生化学的実験に使用する予定である。
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