| 研究課題/領域番号 |
15K19014
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| 研究機関 | 高崎健康福祉大学 |
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研究代表者 |
大森 慎也 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (10509194)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | マスト細胞 / GATA2 / 形質転換 |
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| 研究実績の概要 |
申請者は先行研究において、成熟マスト細胞における転写因子GATA2の役割を解明するためにGATA2コンディショナルノックアウトマウスから骨髄由来マスト細胞（BMMCs）を樹立し、細胞レベルで解析をおこなった。その結果、①GATA2は多くのマスト細胞特異的な遺伝子を正に制御していること、②骨髄球の分化過程に重要な役割を果たすCebpaの発現を抑制することで他の骨髄球系細胞系列への分化を抑制し、マスト細胞の形質を維持していることを見出した（Ohmori et al., Blood 2015）。本申請課題では、この２つ事象が生体内のマスト細胞でも起こりえるのか否か検証することを目的とした。まず平成27年度は、交配によって蛍光タンパク質であるTdTomatoを有するGATA2flox::Rosa26CreERT2::TdTomatoマウスの作成を進め、予定通り得ることができた。次に、TdTomato陽性GATA2欠失BMMCs（T-G2ΔCF-BMMCs）を野生型マウス（C57BL/6）およびマスト細胞欠損マウス（C57BL/6-Kitwsh/wsh）の腹腔内に移植し解析をおこなった。移植後3週間目にそれぞれ移植されたマウスの全腹腔細胞を回収しフローサイトメトリー（FCM）を用いて解析をおこなった結果、GATA2を欠失していないBMMCsは全腹腔細胞中に存在が認められたが、T-G2ΔCF-BMMCsは認められなかった。そこで他臓器へ遊走した可能性を考慮し、脾臓、小腸を採取しFCM解析をおこなったが、腹腔内と同様にTdTomato陽性細胞の存在は認められなかった。
以上の結果から、移植からより短い期間で解析を行なうと共に、マスト細胞特異的CreERT2発現マウスを用いた解析が必要であると考え、現在BAC-DNAを用いたトランスジェニックマウス作成に着手している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成27年度に予定していた移植に用いるTdTomato陽性GATA2欠失BMMCsの作成は予定通り進めることができた。しかしながら移植後の解析においてTdTomato陽性細胞の存在を認めることができなかったため、他臓器への遊走を視野に入れ腸に局在するマスト細胞分離を試みたが、技術的な問題により解析が遅れている。また、当初の予定とは異なるが、マスト細胞特異的CreERT2発現マウスの樹立に関してBAC-DNAの構築作成（Cma1-BAC-CreERT2）を行い、受精卵へのインジェクションを複数回おこなったが、理由は不明であるが現在までに産仔が得られていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
マスト細胞特異的CreERT2発現マウス（Cma1-BAC-CreERT2マウス）の樹立に関しては、外部受託によってマウス作成を進める。また、平成28年度の研究実施計画において、炎症誘発時のマスト細胞におけるGATA2の発現解析を予定しているため、当該施設に導入準備が進んでいるmiltenybiotech社の細胞分散装置を用いて、小腸をはじめ脾臓、肺、皮膚に存在するマスト細胞を分離する系を立ち上げ解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述のように、技術的な困難が生じ予定通りに実験を進められなかった。特に、マスト細胞特異的CreERT2発現マウスの樹立に関して現在までに産仔が得られていないことから、受託作成での樹立を計画したため繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
外部受託によるマスト細胞特異的CreERT2発現マウスの樹立の費用、移植実験に用いるマウスおよび細胞の維持、生化学・分子生物学的な解析に用いる試薬類の費用として使用する。
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| 備考 |
高崎健康福祉大学薬学部
http://www.takasaki-u.ac.jp/faculty/yaku/
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