| 研究課題/領域番号 |
15K19029
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
笠嶋 克巳 自治医科大学, 医学部, 講師 (80382844)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ミトコンドリアDNA (mtDNA) / 線虫 / 欠失型mtDNA蓄積 / mtDNA分配 / TFAM |
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| 研究実績の概要 |
本年度はまず、欠失型ミトコンドリアDNA（以下mtDNA）と野生型mtDNAを安定的にヘテロプラズミック状態で維持する線虫株LB138を用い、mtDNA分配調節機構の解析に向けたアッセイ系の構築を行った。LB138は他のグループによって単離・確立された株であるが、欠失型mtDNAの存在はPCR法を用いた証明しかなく、欠失型mtDNAの存在を確証するものではなかった。そこでサザンブロッティングを行うことにより、約3000塩基対を欠失したmtDNAが実際にLB138に存在していることを証明した。
ヒト培養細胞でmtDNAの均等分配に関わるTFAMの線虫ホモログであるHMG-5が、欠失型mtDNAの分配や蓄積にどのような影響を与えるのかを調べるために、LB138株でHMG-5のノックダウンを行った。具体的には、HMG-5に相当する二本鎖RNAを発現する大腸菌（HT115）を餌としたFeeding RNAiをL1幼虫期から次世代まで連続的に行うことにより、親世代、そのF1世代で効率よくHMG-5をノックダウンすることに成功した。
発生ステージを合わせたHMG-5のノックダウン親虫、およびその子F1成虫10匹ずつからDNAを抽出し、これまでに確立していたリアルタイムPCR法を用いた欠失型mtDNA含有率の定量を行っている。
線虫の胚より単離したprimary細胞において、SYBR Green Iを用いたmtDNAの染色を行い、線虫でのmtDNA核様体の観察にはじめて成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度はLB138株を用いた欠失型mtDNAの分配・蓄積を調べるためのアッセイ系の構築を第一目的とした。その結果、欠失型mtDNAの存在が証明され、サザンブロット法も欠失型含有率の定量に応用可能であることが示された。またL1幼虫から次世代への連続的なFeeding RNAiを行うことにより、親世代とその子世代で効率よく遺伝子のノックダウンが可能となった。よって関連遺伝子のノックダウンによる欠失型mtDNAの親から子への分配を調べるためのアッセイ系の構築には成功しており、この点では順調に進んでいると考えられる。しかしながらHMG-5が実際に欠失型mtDNAの分配・蓄積に関わるのかどうかを決定するには至っていない。また、その他関連因子のノックダウン解析にまで進むことができなかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
最近LB138株を用いた海外のグループの報告より、ミトコンドリアのクオリティー維持に関わり、パーキンソン病の原因因子として知られるParkinのノックアウトが、欠失型mtDNAの蓄積に働くことが示された。本報告はLB138株が欠失型mtDNAの分配・蓄積を解析するための有用なツールであることを示すものである。
現在HMG-5ノックダウンによる親子における欠失型mtDNA含有率を定量し、その変化など解析を進めているところである。複数アッセイからのデータを蓄積し、HMG-5が欠失型mtDNAの分配・蓄積に影響を与えるのかどうか明らかにする。その他mtDNA分配への関与が予想される因子のノックダウンも平行して行い、欠失型mtDNAの分配・蓄積に関わる因子を特定する。
ノックダウンで影響が見られないような遺伝子に関しても、ノックアウトで生育に問題がないようものに関しては、LB138株との二重変異株を作製して欠失型mtDNAの分配・蓄積への影響を調べる。HMG-5はノックアウトで致死であるが、その他2種の関連因子に関しては、生育・繁殖可能なノックアウト株がナショナルバイオリソースで提供されているため、こうした株も利用する。
mtDNAのコピー数が欠失型mtDNAの分配・蓄積に関わるのか調べるために、核酸アナログであるmtDNAの複製阻害剤を用い、mtDNAのコピー数を減少させた場合の欠失型mtDNA含有率を世代間で調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
線虫HMG-5タンパク質に対する抗体作製の委託に至らなかったことが主な理由と考えられる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初の予定通り、研究費の多くは酵素や試薬などの消耗品費として使用する。また成果発表だけでなく情報収集のために各種学会への参加を予定しており、そのための参加費・旅費としても使用する。HMG-5のmtDNA分配への関与が確定した場合、抗体作製のための費用としても使用する。
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