| 研究課題/領域番号 |
15K19083
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 瑞希 旭川医科大学, 医学部, 助教 (00632126)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 条虫 / 多包虫症 / 補体 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに申請者が同定した3つの多包条虫セリンプロテアーゼインヒビター分子（SerpimEmu, Serpin2Emu, Serpin3Emu）について、大腸菌発現系を用いて組換えタンパク質を作成した。 このうち組換え SerpinEmuのみが可溶性となり、他の2つは不溶性となった。そこで酵母を用いて組換えタンパク質を作成したが、可溶性の組換えタンパク質は得られなかった。現在、コムギ胚を用いた無細胞系での発現を試みている。一方、大腸菌を用いて得られた組換えタンパク質を用いてこれら3つのSerpin分子に対するポリクローナル抗体を作成し、幼虫ステージでの局在を観察した。その結果、SerpinEmuおよびSerpin3Emuは胚細胞層および原頭節に発現が見られたが、Serpin2Emuについては石灰小体に強く発現していた。石灰小体は補体活性抑制作用を示すといわれていることから（Kassis and Tanner 1976）、Serpin2Emuの機能解析を行う必要がある。
また、条虫におけるRNAi法の開発について並行して行った。条虫にRNAを注射するまえに色素を注入しその拡散を調べたところ、隣の片節、さらに複数個先の片節まで拡散したため、効果的な抑制効果が得られないのではないかと思われた。そこで、虫卵もしくは六鉤幼虫を二本鎖RNA溶液に浸漬、これを培養下で観察することを考えた。孵化した六鉤幼虫はフィーダー細胞を用いることにより擬嚢尾虫まで発育した。今後、この培養法を用いて初期ステージのRNAi法の開発を試みる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
概ね順調だが、組換えタンパク質の作成に時間を要した。その理由は、Serpin2Emuが発現しなかったことであり、これについてはコドンを大腸菌に最適化した合成DNAを用いることで解決した。しかしながら、Serpin2EmuおよびSerpin3Emuについては、大腸菌および酵母を用いて試みたが可溶性の組換えタンパク質が未だ得られておらず、そのため、機能解析を行うことができなかった。ただし、大腸菌で得られた組換えタンパク質を用いてポリクローナル抗体を作成することができ、局在の観察については重要な結果を得ることができた。また、今年度作成したポリクローナル抗体を用いて、免疫沈降によるSerpinのターゲット分子の特定を行うことができると考えている。
また、Hymenolepisを用いたRNAi法の確立に関しては、条虫に注射する方法では注入した溶液が拡散してしまい、効果が不十分となる可能性が考えられた。そのため新たに六鉤幼虫の培養法を開発し、顕微鏡下で幼虫の初期ステージの発育を観察することができた。これを用いることでRNAiによる表現型の変化を観察しやすくなると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
組換えSerpin2EmuおよびSerpin3Emuについては、現在コムギ無細胞発現系による作成を試みている。これにより可溶性タンパク質が得られれば、予定通り種々のセリンプロテアーゼ阻害作用および補体活性抑制作用について解析する。組換えタンパク質の作成に時間がかかってしまう場合を想定し、作成し得たポリクローナル抗体を用いて、虫体サンプルからnative Serpin2EmuおよびSerpin3Emuを回収することも考えている。
Hymenolepisを用いたRNAi法の確立に関しては、虫卵を2本鎖RNA溶液に浸漬することで発現抑制効果が現れるか試す。表現型の観察には本年度開発した培養法を用い、継時的に顕微鏡下で発育を記録する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
可溶性の組換えタンパク質が得られなかったため、予定していた機能解析を行うことができなかった。解析に使用する各種プロテアーゼおよび基質等の試薬が未購入であるため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在コムギ無細胞系での発現を行っており、これがうまくいけば直ちに試薬を購入し、機能解析を行う予定である。また、局在解析、RNAi技術開発などについては今後も予定どおり進める。
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