日本脳炎ウイルスの蚊細胞への感染機序の解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K19084
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 鍬田 龍星 山口大学, 理工学研究科, 研究員 (00711219)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 人獣共通感染症 / 衛生動物学 / ウイルス学

研究実績の概要

蚊やマダニは人畜を吸血する際にウイルスなどの病原体を媒介する、公衆衛生の重要な節足動物である。これら節足動物によって媒介される病原ウイルスは節足動物媒介性ウイルスArthropod-borne virus（アルボウイルスArbovirus）と総称され、世界中で広く問題となっている。
ウイルスは細胞に感染する際、自身の外皮蛋白質と細胞表面の受容体蛋白質とを連結させて結合する。アルボウイルスの場合、脊椎動物、節足動物に類似またはそれぞれに異なる受容体を利用している。例えば、C 型レクチンや熱ショック蛋白質は脊椎動物と節足動物で高度に保存され、アルボウイルスの受容体として機能している。その他、TIM 蛋白質やインテグリン、ラミニン結合蛋白質、G タンパク質共役受容体などが脊椎動物細胞において、プロヒビチンが昆虫細胞において受容体として機能すると考えられている。
日本脳炎ウイルスJapanese encephalitis virus (JEV) はフラビウイルス科フラビウイルス属に属し、我が国にも常在する代表的なアルボウイルスである。JEV は豚や鳥を増幅動物とし、蚊（主にコガタアカイエカ）によって媒介される。我々は、JEVの感染機序について研究を行う過程で、JEVエンペロープ蛋白質（E）のアミノ酸配列387-399番目に該当するRGD領域（JEV_RGD）が、蚊細胞への効率的な感染に重要な役割を担う可能性があることを見出した。そこで本研究では、このJEV_RGDに着目し、（1）その機能の解明と、（2）JEV_RGDと相互作用する蚊細胞受容体の同定を行い、JEVの蚊細胞への感染機序の解明を目指す。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

(1) JEV_RGDの機能解析；JEVの細胞馴化へ伴う遺伝子変異について解析を行った結果，E蛋白質上のRGD領域が脊椎動物細胞への馴化でのみ変異することを見出した．そこで、脊椎動物の培養細胞への馴化によって得られたJEV_RGD変異株と親株の性状（培養細胞での増殖性、プラークサイズ）と比較することにより、細胞感染におけるJEV_RGDの機能に関する知見を得ることを試みている。これまでのところ、各性状において有意な差は認められていない。
(2) JEV_RGDと相互作用する蚊細胞受容体の同定；JEV_RGD領域はE蛋白質の外部ドメインであることから，この領域が細胞接着因子として機能している可能性が考えられる．そこで，現在，このJEV_RGDと相互作用する、蚊細胞に特異的な受容体の同定を試みている．JEV_RGDを含むペプチド（23aa）をGST-tag融合蛋白質として大腸菌発現系により人工合成し、精製後、フローサイトメーターを用いて合成ペプチドの培養細胞に対する吸着性を調べた。その結果、合成ペプチドは脊椎動物細胞への吸着は認められたが、蚊細胞への吸着は認められなかった。

今後の研究の推進方策

(1) JEV_RGDの機能解析；これまでのところ、培養細胞での増殖性ならびにプラークサイズについて、JEV_RGD変異株と親株で意な差は認められていない。そこで、今後はさらに変異の進んだ株を選抜して比較解析を行い、親株と変異株とで性状の違いを見出すことを試みる。
(2) JEV_RGDと相互作用する蚊細胞受容体の同定；GST-tagを融合させたJEV_RGD合成ペプチド（23aa）は、脊椎動物細胞への吸着は認められたが、蚊細胞への吸着は認められなかった。このことから、実験に供試する合成JEV_E蛋白質に細胞吸着能を付与するためには、RGD領域を含むさらに広いペプチド領域や、蛋白質の立体構造が重要である可能性が示唆された。そこで、次に、細胞への感染・侵入に重要な役割を果たすと考えられているDomain III全体に該当するペプチド（103aa）を人工合成し、実験に供試することを試みている。

次年度使用額が生じた理由

学会参加の旅費を他の費用から捻出したため

次年度使用額の使用計画

試薬等の購入費に充てる

研究成果

• [雑誌論文] Genetic and biological characterization of Muko virus, a new distinct member of the species Great Island virus (genus Orbivirus, family Reoviridae), isolated from ixodid ticks in Japan. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ejiri H, Lim CK, Isawa H, Kuwata R, Kobayashi D, Yamaguchi Y, Ito M, Kinoshita H, Kakiuchi S, Horiya M, Kotaki A, Takasaki T, Madeda K, Hayashi T, Sasaki T, Kobayashi M, Saijo M, Sawabe K
  • 雑誌名: Archives of Virology 巻: 160 ページ: 2965-2977
  • DOI: Journal of Medical Entomology
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Canine distemper virus infection among wildlife before and after the epidemic. (2015)
  • 著者名/発表者名: Suzuki J, Nishio Y, Kameo Y, Terada Y, Kuwata R, Shimoda H, Suzuki K, Maeda K.
  • 雑誌名: Journal of Veterinary Medical Science 巻: 77 ページ: 1457-1463
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analysis of mosquito-borne flavivirus superinfection in Culex tritaeniorhynchus (Diptera: Culicidae) cells persistently infected with Culex flavivirus (Flaviviridae). (2015)
  • 著者名/発表者名: Kuwata R, Isawa H, Hoshino K, Sasaki T, Kobayashi M, Maeda K, Sawabe K
  • 雑誌名: Journal of Medical Entomology 巻: 52 ページ: 222-229
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Isolation of Japanese encephalitis virus and a novel insect-specific flavivirus from mosquitoes collected in a cowshed in Japan. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kuwata R, Sugiyama H, Yonemitsu K, Van Dung N, Terada Y, Taniguchi M, Shimoda H, Takano A, Maeda K.
  • 雑誌名: Archives of Virology 巻: 160 ページ: 2151-2159
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Isolation and characterization of a novel Rhabdovirus from a wild boar (Sus scrofa) in Japan. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sakai K, Hagiwara K, Omatsu T, Hamasaki C, Kuwata R, Shimoda H, Suzuki K, Endoh D, Nagata N, Nagai M, Katayama Y, Oba M, Kurane I, Saijo M, Morikawa S, Mizutani T, Maeda K.
  • 雑誌名: Veterinary Microbiology 巻: 179 ページ: 197-203
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Persistent natural infection of a Culex tritaeniorhynchus cell line with a novel Culex tritaeniorhynchus rhabdovirus strain. (2015)
  • 著者名/発表者名: Gillich N, Kuwata R, Isawa H, Horie M.
  • 雑誌名: Microbiology and Immunology 巻: 59 ページ: 562-566
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment and characterization of two new cell lines from the mosquito Armigeres subalbatus (Coquillett) (Diptera: Culicidae). (2015)
  • 著者名/発表者名: Hoshino K, Isawa H, Kuwata R, Tajima S, Takasaki T, Iwabuchi K, Sawabe K, Kobayashi M, Sasaki T
  • 雑誌名: In Vitro Cellular & Developmental Biology 巻: 51 ページ: 672-679
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 重症熱性血小板減少症候群（SFTS）．特集・ウイルス感染症との新たな戦い～グローバル化する脅威の克服を目指して～ (2015)
  • 著者名/発表者名: 鍬田龍星，前田健
  • 雑誌名: 医薬ジャーナル 巻: 51 ページ: 99-105
• [学会発表] Adaptation of Japanese encephalitis virus to mammalian cells and discovery of novel mosquito-borne viruses (2016)
  • 著者名/発表者名: Kuwata R
  • 学会等名: International Symposium on Intracellular Pathogens, Yamaguchi 2016
  • 発表場所: 山口県山口市（山口大学）
  • 年月日: 2016-02-05
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 吸血蚊の生態と保有ウイルスの調査 (2015)
  • 著者名/発表者名: 鍬田龍星、杉山弘樹、黒田雄大、米満研三、Nguyen Van Dung、南昌平、濵﨑千菜美、神先芽衣、下田宙、高野愛、前田健
  • 学会等名: 私立大学戦略的研究基盤形成支援事業シンポジウム‘話題の感染症を科学する’
  • 発表場所: 神奈川県藤沢市（日本大学）
  • 年月日: 2015-12-11 – 2015-12-12
• [学会発表] Identification and characterization of a novel RNA virus isolated from mosquito (2015)
  • 著者名/発表者名: Kuwata R, Sugiyama H, Hamasaki C, Minami S, Yonemitsu K, Dung NV, Shimoda H, Maeda K
  • 学会等名: The 63rd Annual Meeting of the Japanese Society for Virology
  • 発表場所: 福岡県福岡市（福岡国際会議場）
  • 年月日: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [学会発表] 蚊から分離された新規RNAウイルスの解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 鍬田龍星，杉山弘樹，黒田雄大，南昌平，米満研三，下田宙，前田健
  • 学会等名: 第158回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 青森県十和田市（北里大学）
  • 年月日: 2015-09-07 – 2015-09-09
• [学会発表] Characterization of Japanese encephalitis virus adapted to cells (2015)
  • 著者名/発表者名: Kuwata R, Takenouchi A, Kimura N, Minami S, Yonemitsu K, Shimoda H, Maeda K
  • 学会等名: 第50回日本脳炎ウイルス生態学研究会
  • 発表場所: 京都府京都市（京都エミナース）
  • 年月日: 2015-05-15 – 2015-05-16