| 研究課題/領域番号 |
15K19087
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
牧内 貴志 東海大学, 医学部, 助教 (80587709)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 赤痢アメーバ / 原虫 / 寄生虫 / マイトソーム / ミトコンドリア関連オルガネラ / ミトコンドリア / ダイナミン関連タンパク質 / 進化 |
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| 研究実績の概要 |
赤痢アメーバは、その生活史全体で重要なオルガネラとして特殊化したミトコンドリア“マイトソーム”を持つ。しかしながらマイトソームにおいて、分裂によってその数を増やすメカニズムは明らかとなっていない。一方、ヒトなどでは、ミトコンドリア外膜上にリクルートされたダイナミン関連タンパク質（DRP）が膜切断を実行するリング状複合体を形成するというモデルが考えられている。赤痢アメーバもゲノム中に４種類のDRP（EhDrpA～EhDrpD）を保持し、マイトソームの分裂にもDRPの関与が予想できる。本申請では、マイトソームとミトコンドリアの分裂メカニズムの進化的な共通点および創薬標的の可能性を秘めた相違点を明らかにすることを目指している。
平成２７年度は、マイトソームの分裂とDRPの関連を検証するために、まず免疫蛍光抗体法によるDRPの局在解析を行った。その結果、EhDrpAとEhDrpBが細胞質とマイトソームに、EhDrpCとEhDrpDが核に局在することを明らかにした。この細胞内局在の違いは、EhDrpAとEhDrpB、EhDrpCとEhDrpDがそれぞれ単系統を形成するという分子系統学的解析からも支持された。また、EhDrpAもしくはEhDrpBの活性を阻害するような変異型DRPの発現や発現抑制を行うことによって、顕著に伸長したマイトソームが観察された。以上から、EhDrpAとEhDrpBの２種類のDRPがマイトソームの分裂に関与することが強く示唆された。さらに、EhDrpAとEhDrpBの免疫沈降実験を行った結果、これらのタンパク質がヘテロ複合体を形成する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２７年度に実施完了予定であった免疫電子顕微鏡法を用いた観察は、現在解析中であり若干の遅延があるが、それ以外はほぼ順調に進行しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２８年度は、平成２７年度に未達成となってしまった免疫電子顕微鏡法を用いた解析を継続しつつ、当初の計画通りにEhDrpAおよびEhDrpBをマイトソームへとリクルートするパートナー分子候補の探索を行う。
平成２７年度内に行った免疫沈降法による予備実験では、既にいくつかのタンパク質を同定しているが、有望な候補分子の同定には至っていない。この原因として、解析に用いた検体が細胞全体の可溶化液であったためと考えられる。この問題を解決するために、単離したマイトソームの可溶化液を用いた再解析を予定している。また、EhDrpAおよびEhDrpBと推定のパートナー分子との相互作用が弱い可能性も考えられるので、架橋剤を用いた実験系も検討している。予備実験では、架橋剤存在下でもマイトソームの単離に影響を与えないことが示唆されている。有望なパートナー分子の同定に至った場合は、パートナー分子側からのDRPとの結合能の検証実験をin vivoおよびin vitroで行う予定である。一方、パートナー分子の探索が難航した場合は、EhDrpAおよびEhDrpBとマイトソーム膜が直接結合する可能性も考えられるため、この可能性の検証実験を行う。
当初の計画以外の解析としては、平成２７年度の解析結果から、EhDrpAとEhDrpBがヘテロ複合体を形成する可能性が浮上したので、その検証実験を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２７年度に終了予定だった免疫電子顕微鏡法による解析の費用がかからなかったため。また、論文投稿料などがかからなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２７年度の繰越金に関しては、主に免疫電子顕微鏡法による解析の費用に使用する予定である。
平成２８年度分に関しては、申請時の内容で使用する予定である。
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