| 研究課題/領域番号 |
15K19115
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
石川 知弘 獨協医科大学, 医学部, 助教 (40609327)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 日本脳炎ウイルス / ゲノム環状化 / 相補性 / RNA複製 / ウイルスタンパク翻訳 |
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| 研究実績の概要 |
日本脳炎ウイルス（JEV）のゲノムRNA両端には4組の相補配列（CS）が認められる。デングウイルスやウエストナイルウイルスなど同属のウイルスではCSを介してゲノムRNAが環状化し、ウイルス複製に寄与することが報告されている。JEV複製機構におけるCSの機能解析を目的とし、ルシフェラーゼ発現JEVレプリコンを用いた解析を昨年度から継続して行った。CS領域に変異を導入し、相補性を喪失したレプリコンおよび相補性を維持したレプリコンを作製し、哺乳類細胞および蚊細胞内での複製効率を解析したところ、4組のCS全てがウイルス複製に関与することが示された。さらに、その機構としては相補性依存型と配列依存型の2種が存在することが明らかになった。これらはJEVゲノムRNA上に認められるステムループなどの二次構造の機能を明らかにする上で重要所見であると考えられる。
また、ゲルシフトアッセイにより、ゲノムRNA両端同士が結合することも示していたが、試験管内反応だけでなく細胞内での結合を確認するため、ルシフェラーゼ発現レプリコンを恒常発現する培養細胞を樹立した。この細胞にゲノム両端部分に相当する人工合成RNAを導入してルシフェラーゼ活性を比較解析したところ、野生型RNA導入群では活性の低下が観察され、変異型RNA導入群では活性低下は認められず、野生型RNAが細胞内でのゲノム環状化を競合阻害した結果であると考えられた。これらの結果から、JEVゲノムは細胞内でも環状化し、なおかつこの環状化がRNA複製に重要であることが明らかになった。また4組のCSの比較において環状化に最も寄与するのは他の類縁ウイルスとの相同性の高いcyclization sequenceと呼ばれるCS領域であることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ルシフェラーゼ発現JEVレプリコンを用いた解析は計画通りに行った。また、昨年度条件設定に時間を要したNon-RIゲルシフトアッセイについても計画通り解析を進めていたが、本解析においてRNA断片を混合後の結合反応を定法に従い95℃に加熱して実施していたが、研究集会においてJEVの生活環に95℃という高温環境が無いとの指摘を受け、JEV生活環にある哺乳類および蚊の体温である37℃および28℃の条件下で再度解析を行うことにしたが、今年度内には全て終了することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はNon-RIゲルシフトアッセイを4組のCS全てについて、哺乳類（37℃）および蚊（28℃）体温で結合反応を行い、再度実施する計画である。また、これまでに得た結果についても再現性を確認する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Non-RIゲルシフトアッセイのRNA結合反応を定法に従い95℃加熱して実施していたが、日本脳炎ウイルスの生活環にそのような高温環境はないとの指摘を受け、哺乳類の体温である37℃および蚊の体温である28℃条件下で再度実施する必要が生じたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
日本脳炎ウイルスのゲノム両端の相補配列が結合するかどうかをNon-RIゲルシフトアッセイを行い解析する。その際、RNA結合反応は哺乳類の体温である37℃および蚊の体温である28℃条件下で行う。
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