| 研究課題/領域番号 |
15K19477
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
三橋 弘明 東海大学, 工学部, 講師 (20466220)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 筋ジストロフィー / FSHD / DUX4 |
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| 研究実績の概要 |
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)は最も患者数の多い型の筋ジストロフィーの１つであり、DUX4遺伝子が原因遺伝子として注目されている。DUX4は選択的スプライシングにより２種類の転写因子タンパク質、DUX4-flとDUX4-sを産生するが、DUX4-flのみが細胞毒性を持ち、DUX4-sは毒性を持たない。本研究では17種類のDUX4変異体を作製し、DUX4の細胞毒性と転写活性、ドメイン構造の関係について検討をおこなった。その結果、DUX4の細胞毒性と転写活性の間に非常に強い相関があることが明らかとなった。また、DUX4の毒性と転写活性を担う約20アミノ酸残基の領域を特定した。この領域を阻害することでDUX4による毒性を抑制できる可能性があると考えている。また、DUX4は核に局在し、その局在はN末端側ドメインに依存していることが示唆された。核外移行シグナルの融合により、DUX4の核内移行を抑制したが、細胞毒性を抑えることはできなかったため、DUX4の局在変化による治療法を目指す場合は、完全なDUX4の核内移行阻害が必要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
DUX4変異体を合計17種類作製した。これらの変異体をヒト培養細胞であるHeLa細胞に発現させた結果、全ての変異体が核に局在することが確認された。また、ウェスタンブロットの結果、一部の変異体にDUX4の二量体化の傾向が見られ、DUX4タンパク質の機能の発揮との関連が示唆された。さらに、昨年度に確立したHeLa細胞を用いた実験系を用い、細胞毒性と転写活性について検討した結果、DUX4の細胞毒性と転写活性がよく相関することが示された。また、この解析によりDUX4の毒性及び転写活性の発揮に必要なタンパク質領域を約20アミノ酸残基まで絞ることができた。DUX4のC末端側に核外移行シグナルを融合し、DUX4の核内移行の抑制を試みたが、細胞毒性およびDUX4標的遺伝子の活性化を抑制することはできなかった。これはDUX4の転写活性が非常に強力であるため、わずかでも核内に存在すると著しく標的遺伝子を活性化してしまい、十分な毒性を発揮するためと推測された。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は特にDUX4が活性化する標的遺伝子群に焦点をあて、DUX4を発現させたゼブラフィッシュにおける遺伝子発現変化をトランスクリプトーム解析することを主眼に研究を行う予定である。これまでに作製したDUX4変異体コンストラクトを鋳型にmRNAを合成し、マイクロインジェクションによりゼブラフィッシュにDUX4変異体を発現させて、RNA-seqなどの手法で遺伝子発現を網羅的に解析し、DUX4発現が筋発生に与える影響を明らかにする。
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