| 研究課題/領域番号 |
15K19479
|
|---|
| 研究機関 | 新潟大学 |
|---|
研究代表者 |
石原 智彦 新潟大学, 脳研究所, 助教 (70612232)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | ALS / 介在ニューロン / iPS細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
平成27年度に，1) ホルマリン固定パラフィン包埋組織 (FFPE) からのレーザーマイクロダイセクション（LMD）を使用したRNA回収と解析方法の検討，2) iPS 細胞の運動神経への分化誘導 を行った．
ヒト脊髄のFFPE標本を使用し，遺伝子Xを対象に検討した．脱パラフィン，Cresyl violet 染色後に．Leica LMD 7000 (Leica Microsystems)を使用し，LMDを行った．miRNeasy FFPE kit (Qiagen) にて，total RNA を回収し，逆転写反応により相補的DNA cleanを作成した．定量にはddPCR法を選択した．FFRP検体ではmRNAの断片化が知られている．実際に同一遺伝子領域で，51bp，108bp の増幅産物でddPCRを施行すると，増幅効率に明らかな差を認めた．今後の測定に際しても増幅産物サイズに留意する．
2) 介在ニューロンの作成に先立ち，運動ニューロンの作成を行った．iPS細胞はコントロールおよび家族性ALS患者由来のものを用いた．iPS細胞継代の翌日よりDorsomorphin，SB431542，CHIR99021を 添加し，神経分化指向性を強化した． Primary neurosphere（PNS）形成誘導のために，基礎培地を DMEM/F12-Glutamaxに変更し，3日目よりRetinoic acid （RA），Purmorphamineを加えた．PNS形成誘導開始から， 15日でpolyQ/Lamininコートしたplateに播種を行い，運動ニューロン分化用のmediumにて7-10日間培養した．得られた細胞が，ISL-1, CｈATのmRNA，蛋白質の発現がみられる事を定量PCR，Western blot法にて確認し，運動ニューロンへの分化を確認した．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画した予定に準じ，パラフィン包埋からの細胞の切り出し，iPS 細胞の作成を行えている．
|
| 今後の研究の推進方策 |
介在ニューロンの切り出しと解析を進める．
今後はiPS細胞からの介在ニューロンの作成に進んでいく予定である．
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
既に保有する試薬，検体を中心に用いたため，使用予算が当初見込みより減額された．
|
| 次年度使用額の使用計画 |
当初の実施予定にのっとり，iPS細胞の維持管理，FFPE検体からのmRNA定量を継続する．
|
