| 研究課題/領域番号 |
15K19500
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
植田 晃広 藤田保健衛生大学, 医学部, 准教授 (20600703)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | sphingomyelin / sphingomyelinase / lipid raft / GM1 |
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| 研究実績の概要 |
nSMase分子の局在と活性の把握：すでに作成したラットの褐色細胞腫由来細胞のPC12細胞と、ヒトtrk-cDNAを強発現させたstable transfectantであるPCtrk細胞を実験に使用する。これらの実験は未分化のPCtrk細胞と、NGFで交感神経様神経細胞に分化させたPCtrk細胞を用いて比較検討を行った。抗GM1抗体の濃度を1000-3000倍希釈し、未分化PCtrk細胞と分化したPCtrk細胞を用いてnSMase分子がどのように局在変化するか、細胞のsubcellular protein fractionation法で細胞の各画分のsampleを得る、また、ショ糖密度勾配超遠心法でraft画分と非raft画分のsample得る。これらのsampleをWestern blot法（WB法）で同定した。更に、細胞免疫染色法によってnSMaseの抗GM1抗体作用による局在変化を調べた。
nSMase活性の変化は、whole cellと、subcellular protein fractionation法とショ糖密度勾配超遠心法で得られた各画分の活性を測定した（Amplex® Red Sphingomyeklinase Assay Kit, Invitrogen）。
lipid rafts構造への影響と同定：上記と同様にPCtrk細胞を用いて実験を行った。serum-freeDMEMを用い1000-3000倍希釈となるようにした抗GM1抗体で時系列を振りPCtrk細胞を処理する。細胞溶解物と、それをショ糖密度勾配超遠心法で処理しlipid rafts画分を調整したものにわけた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
lipid rafts画分のGM1をはじめとする酸性糖脂質、中性糖脂質、SM、セラミド、コレステロールの量、またlipid raftsのマーカー蛋白であるRas蛋白（低分子量GTP結合蛋白）、prion蛋白などの量的な変化を解明し、抗GM1抗体によりlipid raftsで引きおこされる構造の変化を解析する。という平成27年度の目標の一部が未だ行えていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に行う予定であった前述の内容を行うとともに、平成28年度分の実験を実施していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究がやや遅れているるため、必要な物品の購入も遅れているため、次年度使用額が生じました。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画に沿って変更なく使用していきます。
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