2015 年度実施状況報告書

IL-33依存性気道炎症おける血小板関与の解析

研究課題

研究課題/領域番号	15K19581
研究機関	関西医療大学
研究代表者	竹田知広関西医療大学, 保健医療学部, 講師 (20717665)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2017-03-31
キーワード	IL-33 / 血小板 / 喘息
研究実績の概要	喘息発作時に血小板の活性化や凝固系の亢進を認めること、抗血小板薬が喘息症状を改善することより、喘息発作の増悪に血小板の活性化が関与することが示唆されている。しかし、その機序については、不明な点が多い。今回、血小板中アレルギー疾患で重要なサイトカインIL-33蛋白発現を認める予備データを得た。IL-33蛋白の局在は、核内に発現するが、今回無核の細胞である血小板におけるIL-33蛋白発現を認めることより、アレルギー疾患発症に血小板関与の可能性を示唆してる。具体的には計画書の通り、①血小板におけるIL-33 発現機構の解明、②血小板におけるIL-33 蛋白分泌機構の解明を中心に検討を行った。①については、ヒト巨核球細胞株MEG-01、マウス骨髄巨核球を用いて発現について検討を行った。また、生体内環境に応じて発現量変化の有無を各種サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-9,IFN-γ)を添加細胞培養しIL-33発現量をフローサイトメトリーで評価した。MEG-01を用いて、IL-33発現をウエスタンブロットで検討を行った結果、核分画には発現を認めず、細胞質分画に全長IL-33発現を認めた。マウス骨髄巨核球の免疫染色でも、細胞質に一致してIL-33の発現を確認した。サイトカイン添加MEG-01での検討では、用いたサイトカイン刺激では、IL-33発現量に有意な差を認めなかった。②については、MEG-01及びヒト血小板分離後、トロンビンを添加し、血小板を活性化し上清中のIL-33の測定を行った。両細胞共に上清中にIL-33を認めた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初の実験計画通り、実験を実施し、マウス及びヒト血小板中に全長のIL-33を認めたこと、血小板の活性化に伴い分泌されることが確認された。また、巨核球では、細胞質にIL-33を認めた。血小板は、巨核球細胞質のfragmentationにより産生されることより上記の結果は、矛盾しない。
今後の研究の推進方策	当初の計画書通り、本年度は、①血小板由来IL-33 標的細胞の同定②血小板を標的細胞とした新規アレルギー治療の開発を実施する。プロテアーゼ惹起IL-33依存性好酸球モデルを用いて、血小板の有無によりエフェクター細胞の同定および抗血小板薬を投与し、炎症の程度を評価する。具体的には、血小板の有無により肺でのILC2、好塩基球数をフローサイトメトリーで評価、また、mRNAの発現量により標的細胞を同定する。また、抗血小板をマウスに投与し、同モデルでの好酸球浸潤の程度を評価し新規治療法を開発を目指す。
次年度使用額が生じた理由	本年度予定の実験は順調であったこと、次年度の計画の血小板由来IL-33 標的細胞の同定血小板由来IL-33 標的細胞の同定を実施するが、想定されている標的細胞の種類が多く、同定用抗体額が当初予定よりも約1000千円程度多くかかる見込みであるため、前年度実施の培養実験でスケール少量にしたことで、使用試薬量が予定使用量より少量で実施できた。
次年度使用額の使用計画	当初の計画書通り、次年度は、血小板由来IL-33 標的細胞のフローサイトメーターを用いて同定を行う。また、標的細胞をセルソーターで分離し、血小板との共培養をおこなう。計画書段階よりも想定されている標的細胞の種類が多く、また、例えば、Type2 innate lymphoid cellの検出では、Lineageマーカー(CD3,CD4,CD8α,CDllc,CD19,TCRβ,TCRγδ,B220,NK1.1,Mac-1,Gr-1,FcεR1α)陰性でc-KitおよびSca-1を発現する細胞であり、同定用抗体額が当初予定よりも約1000千円程度多くかかる見込みである。