| 研究課題/領域番号 |
15K19589
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
吉田 春乃 北里大学, 感染制御科学府, 助手 (70563386)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 劇症型レンサ球菌感染症 / GAS / 転写調節因子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題「劇症型A群レンサ球菌感染症における新たな病原因子制御メカニズムの解析」では、A群レンサ球菌（GAS）が持つ制御因子であるRocAに着目し、rocAをコードする遺伝子に自然発生的な変異を持つ臨床分離株を用いて、病原性に対する役割の解析を試みている。平成２８年度の計画と結果は以下の通り。
(1)レンサ球菌RNA抽出方法の確立とrocA発現様式解析；レンサ球菌はグラム陽性菌であり、菌体の効率的な破砕がグラム陰性菌に比して困難である。検討の結果、液体窒素で凍結した菌体を超音波で破砕し、素早くRNA保護剤に溶解することで、RNA分解の極めて少ない核酸サンプルを大量に得られることがわかった。また、培養条件によりrocA遺伝子の発現様式が変化するかについては、現在リアルタイムPCRにより引き続き検討中である。
(2)組換えGASの遺伝子発現網羅的解析；臨床から分離したMTB313,MTB314株に加え、rocA遺伝子を発現ベクターによって相補したMAT101とそのコントロール株MAT100について、上記の方法でtotalRNAを抽出し、これを用いてマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現様式の解析を行った。得られたデータをもとに比較解析を行なったところ、MTB313ではMTB314に比べてslo, sic, ska等の病原因子の発現が多いことがわかった。また、CRISPR関連遺伝子の発現もMTB313の方が高い。反対に、代謝関連遺伝子、および転写調節因子の発現はMTB313の方が少ない傾向が見られた。今回明らかになった遺伝子発現プロファイルの中には、rocAとのクロストークが推測されている転写調節因子Rggになんらかの影響があった結果と解釈できるものがあり、既報告を裏付ける、あるいは更なる示唆をもたらすものだと言える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度の課題であった、MTB314を基にしたrocAノックアウト相補株の作成については、今年度の前半に引き続き取り組んだ。λ-Red recombinaseを共存させた相同組み替え促進系を計画し、試みたが組換え体を得ることができなかった。そこで相補株としてはMAT100,MAT101のみを以降の研究に用いることとした。
このため研究計画が当初より数ヶ月遅延しており、リアルタイムPCRによるrocA遺伝子の発現様式の解析が平成２９年度に一部ずれ込むこととなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)リアルタイムPCRによるrocA遺伝子の発現様式の解析；培養条件を変えた場合、環境がrocA遺伝子の発現に及ぼす影響を調べる。rocA遺伝子のプライマーを用いて定量が行えることは既に確認済みである。
(2)組換えGAS感染マウスの病態解析；GASは本来マウスには感染しないとされているが、ヒトの病態に似た感染を起こさせるためGAS表面タンパク質であるMproteinのレセプターCD４６を全身に発現しているトランスジェニックマウスを用い、MTB313, MTB314, MAT100, MAT101の感染実験を試みる。
(3)ヒト由来培養細胞を用いた、MTB313,MTB314,MAT101,MAT100の細胞内侵入性の比較；株化培養細胞を用い、GASの細胞内侵入性を比較する系を当研究グループで確立中であり、その系を用いて当研究課題に用いている４株の比較を行う。病原性の一つの指標になりうるものであり、MTB313の強毒化に細胞侵入能が関与しているかを判断できうる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画ではMTB314のrocAを欠失させた相補株およびそのコントロール株を作成し、合わせてマイクロアレイ解析に供する予定であった。しかしながら欠損株は得られず、マイクロアレイに供するサンプル数が減ったことで、大幅な未使用金が発生した。さらに、業者のキャンペーンで当初の見積もりよりも大幅に安価にマイクロアレイ解析が行えたこと、解析内容が手厚く、追加解析料金がかからなかったことも理由である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
GAS培養条件によるrocAの発現解析の条件を増やし、より幅広い状況でのrocA発現解析を行う予定であり、繰越し金はその試薬購入に充てる。
また、当研究室で構築中の、細胞内へのGASの侵入性評価系に、MTB313,MTB314,MAT100,MAT101を供することでさらなる知見を得ることができると予想し、研究計画に加える。その試薬購入に充てる。
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