| 研究課題/領域番号 |
15K19605
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
伊川 泰広 金沢大学, 大学病院, 特任助教 (10722043)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | メチル化 / MLL融合タンパク / 遺伝子導入 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、MLL遺伝子再構成を有する乳児急性リンパ性白血病（MLL-R ALL）の病態解析と新規治療法開発を目的としている。MLL-R ALLでは、アポトーシスに関連する遺伝子がメチル化されている事が報告されており、エピジェネティクスに関連した遺伝子発現制御機構が病態に関与している事が示唆される。過去に我々はMLL-R ALLで特徴的な所見であるCD10タンパクの陰性化の機序に、CD10遺伝子プロモーター領域のメチル化が関与している事を報告した。すなわち、MLL融合タンパクがエピジェネティクスに関与し、アポトーシス関連遺伝子をメチル化する病態が示唆された。
そこで、CD10タンパク発現陽性の急性Bリンパ芽球性白血病細胞株（HAL-01）にMLL融合遺伝子を導入しCD10タンパクが陰性化することで、MLL融合タンパクによるメチル化機構が確認でき、導入前後での遺伝子発現プロファイルを解析することで、中心的役割を果たす遺伝子を同定することが可能だと考えた。
患者検体よりクローニングしたMLL-AF9融合遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子と共に発現するレトロウイルスベクターに搭載し、パッケージングセルラインであるPA317細胞株にトランスフェクションしG418と共培養する事でstable cell lineを作成した。レトロネクチンを用いて、培養細胞用プレートにレトロウイルスを接着させ、そこにHAL-01細胞株をプレートの底に遠心沈降させ、レトロウイルスと感染させた。G418と共培養することでMLL-AF9タンパク発現細胞のみを培養することを可能とした。CD10タンパクの発現をフローサイトメトリー法を用いて解析した。CD10タンパクは予想とは反して陰性化しなかった。その原因となる因子を検索中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、MLL-AF9遺伝子導入後の細胞は、CD10タンパクの発現が低下していると予想していた。CD10タンパクの発現低下は、メチル化機構が働き始めたことを示唆する所見であり、遺伝子導入前後の細胞をそれぞれ免疫不全マウス’NOGマウス’に投与し、生存曲線などで細胞の特性を比較することを今年度中の予定としていた。しかし、CD10タンパクの発現が遺伝子導入後においても認められなかった。これには、種々の仲介している分子の関与が推測される。メチル化機構における重要なタンパクとして、PU.1タンパの関与が挙げられる。HAL-01細胞株でのPU.1タンパクの発現を検討しておらず、今後検討していく必要がある。そのため、新着状況としては”やや遅れている”とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、MLL-AF9遺伝子導入後、HAL-01におけるCD10タンパクの発現を抑制させるために必要な分子を同定する。CD10タンパクの陰性化を確認できたのち、遺伝子導入前後の細胞をNOGマウスに投与し、細胞の特性を比較する予定としている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、今年度中にマウス実験を行う予定であったため、予定使用額として１３０万円としていた。しかし、実験計画が変更となったためマウス実験を施行することができず、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度、マウス実験を行う前にin vitro実験を行い、MLL-AF9遺伝子導入後にCD10タンパクの発現を陰性化させることを確認する。その後、そのデータを用いてマウス実験を施行する予定としている。そのため、次年度では、今年度使用する予定としていた研究費を使用する予定としている。
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