| 研究課題/領域番号 |
15K19615
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
宇野 愛海 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30733357)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 人工染色体 / 染色体工学 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 微小核細胞融合法 |
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| 研究実績の概要 |
本年度においては、以下に示す実験を「研究目的」、「研究実施計画」に沿って行った。
一般培養細胞を用いての任意の不要染色体領域を全て除去するために、任意の複数の標的候補配列に対して切断可能なCRISPR/Cas9 および、ターゲティングベクターを作製し、CelI assayにより切断可能かを検討した。また、CRISPR/Cas9 に誘導される相同組換えにより、任意標的箇所にloxP 配列もしくは人工テロメア配を挿入し、染色体改変を行い不要染色体領域を削除するための条件を検討した。本年度は、CRISPR/Cas9誘導性の遺伝子挿入および、不要染色体領域の削除が可能な条件を検討するため、CHO細胞内におけるHACの構築、ヒト染色体の改変を試みた。
その結果、CHO細胞内にて、任意のヒト染色体上の標的配列にて切断活性をしめす、CRISPR/Cas9を作製することが出来た。また、CRISPR/Cas9により相同組換えを誘導することにより、任意の箇所に目的DNA配列を挿入する手法、および、テロメア配列を付加することにより、任意の箇所で染色体を切断することが出来る手法を確立した。また、改変された染色体については、CHO細胞内から、ヒト細胞株へと微小核細胞融合法にて移入することが出来た。
一方で、ヒト細胞を染色体供与細胞とする微小核細胞融合法については、不死化間葉系幹細胞を用いて微小核形成法を検討したが、今後も薬剤処理方法検討の必要性があるという結果であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
目的箇所を切断するCRISPR/Cas9については、想定よりも簡便に作製、評価可能であることが分かった。CRISPR/Cas9 に誘導される相同組換えにより、任意標的箇所にloxP 配列もしくは人工テロメア配を挿入し、染色体改変を行い不要染色体領域を削除するための条件を計画に沿って検討し、達成することが出来た。
一方で、ヒト細胞を染色体供与細胞とする微小核細胞融合法については、不死化間葉系幹細胞を用いて、コルセミド処理、ヘスペラジン処理、両薬剤併用処理を行ったが、コルセミド低濃度単独処理がもっとも形成率がよかったものの、細胞死が多く、今後も薬剤処理方法検討の必要性があるという結果であったが、想定の範囲内である。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験計画に沿って、ヒト細胞内でのCRISPR/Cas9を用いた、X染色体改変に着手する。
また、ヒト細胞を染色体供与細胞とする、微小核細胞融合法の確立に向けて薬剤処理方法を中心に検討する。
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